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猴痘病毒A29L蛋白的生物信息学分析

2024-04-12 8 上传者：管理员

摘要：目的运用生物信息学分析软件对猴痘病毒A29L蛋白的结构和功能进行预测。方法从NCBI网站上获取猴痘病毒A29L基因及编码A29L蛋白的基本信息，利用NCBI、OFR Finder、ProtParam、ProtScaleon Expasy、SignalP 4.1、TMHMM-2.0、NetPhos 3.1 Sever、SOPMA、SWISS-MODEL、ABCpred、SYFPEITHI、BLAST等生物信息学工具对猴痘病毒A29L蛋白的结构和功能进行预测。结果 A29L蛋白是由110个氨基酸组成的亲水性蛋白，含有19种氨基酸，2个开放阅读框。A29L蛋白相对分子质量为12.559 24×103,理论等电点5.73,不稳定系数32.28,是稳定蛋白。A29L蛋白存在10个磷酸化位点，无跨膜区、信号肽；A29L蛋白二级结构中α-螺旋占比最高，占57.27%,无规则卷占32.73%;B细胞有11个(score>0.5)抗原表位，CTL细胞有6个(score≥21)抗原表位，Th细胞有10个(score≥20)抗原表位。A29L蛋白有8个同源性较高的蛋白。结论 A29L蛋白是具有多个潜在的T、B细胞抗原表位的稳定亲水性蛋白，可作为猴痘治疗和疫苗的候选蛋白。

关键词：
A29L蛋白
人畜共患
猴痘病毒
生物信息学
疫苗
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猴痘病是一种人畜共患传染病，其主要宿主、传播方式和维持周期尚未完全确定[1]。猴痘根据遗传和表型差异分为中非分支和西非分支，中非分支的传染性和毒力较强[2]。至2022年10月30日，世卫组织报告了77 264例猴痘确诊病例和36例死亡病例，涉及109个国家和地区[3]。国内2022年9月16日报告了首例输入型猴痘病例[4]。2023年6月，中国内地新增106例猴痘确诊病例[5]。猴痘临床症状跟天花类似，但有一些猴痘的独特特征，例如在病程早期发热时发生淋巴结肿大[6]。美国猴痘感染的主要临床特征包括淋巴结肿大、特异性皮疹、发热、寒战、头痛和肌痛等，一般持续2～4周[7]。猴痘病毒感染者死亡率为0%～11%，其中以儿童死亡率最高[8]。猴痘从动物传播给人类的方式包括直接接触感染动物的患病部位或体液、被动物抓挠或咬伤、食用感染动物的肉等。猴痘的人际传播是与感染猴痘病毒的患者密切接触引起的，包括猴痘患者呼吸道分泌物、患者的床上用品和衣服、与感染猴痘患者面对面接触等[9]。目前已报道了相关并发症，包括继发性细菌感染、支气管肺炎、脓毒症或脑炎。如感染晚期艾滋病病毒者等免疫功能低下者，容易重症病程[10]。猴痘病毒来势汹汹，但目前没有对应的疫苗和特效药[11]，所以研究开发猴痘的特效药和疫苗是必要的。

猴痘病毒属于正痘病毒属，该种属包括骆驼痘病毒、天花病毒、牛痘病毒等[12]。猴痘病毒是一种包膜双链DNA病毒，基因组大小约为197kb，被包裹在直径为140至260nm的椭圆形、哑铃形核心中，形成病毒粒子。基因组两端均有闭合的发夹、反向末端重复序列[13,14]。其中A29L是细胞内成熟病毒（Intracellular mature virion,IMV）表面包膜蛋白，在促进病毒与细胞融合方面发挥重要作用，是理想的药物靶点[15]。通过开发相关的阻断药物可以抑制病毒融合细胞，起到治疗与降低病毒载量的作用，本研究分析A29L蛋白的结构和功能，为理想靶点药物和疫苗的开发提供一定的借鉴。

1、材料与方法

1 A29L蛋白氨基酸序列及其编码基因序列的获取

登录NCBI数据库获取A29L蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列。

2方法

2.1 A29L基因序列分析

通过NCBI的ORF Finer分析A29L基因的开放阅读框。

2.2 A29L蛋白的基本理化性质及亲疏水性

通过ProtParam工具预测分析A29L蛋白的相对分子质量、理论等电点、不稳定系数等理化性质；通过ProtScale预测分析A29L蛋白的亲水性。

2.3 A29L蛋白信号肽和跨膜区预测和磷酸化位点分析

过TMHMM Server v.2.0预测分析A29L蛋白是否存在跨膜区；通过SignalP 4.1 Server)预测A29L是否存在蛋白信号肽；NetPhos 3.1 Server分析A29L蛋白磷酸化位点。

2.4 A29L蛋白的二、三级结构

利用SOPMA软件预测A29L蛋白的二级结构；SWISS MODEL构建A29L蛋白三级结构。

2.5 A29L蛋白的抗原表位

利用ABCpred预测A29L蛋白B细胞抗原表位，通过SYFPEITHI预测A29L蛋白T细胞抗原表位。

2.6 A29L蛋白的同源性分析

利用BLAST进行A29L蛋白的同源蛋白分析。

2、结果

1猴痘A29L基因相关信息及序列分析

从NCBI GenBank数据库获取猴痘A29L基因序列，登录号(NC_063383.1)。A29L基因序列长333 bp,位于猴痘全基因组的137 718～138 050位置。ORF Finger显示A29L序列含有2个开放阅读框架(图1),其中最长的ORF1全长为333 bp,编码110个氨基酸。

表1 A29L蛋白B细胞抗原表位预测

图1 A29L基因开放阅读框架

2 A29L蛋白的理化性质和亲水性

运用Protparam预测猴痘A29L蛋白由110个氨基酸组成，包含19种氨基酸，其中包括谷氨酸(10.9%)、赖氨酸(10.9%)、苏氨酸(10.0%)、丙氨酸(9.1%),分子式为C549H887N153O175S4,包含1 768个原子，相对分子质量为12.559 24×103,理论等电点为5.73。其中脂肪族氨基酸系数为73.73,不稳定系数为32.28,属于较稳定蛋白。使用ProtScale软件对A29L蛋白进行亲疏水性预测(图2),其中最大亲水性系数为1.567,最小为-2.589,平均亲水系数为-0.750,为亲水性蛋白。

3 A29L蛋白信号肽、跨膜区预测和磷酸化位点

SignalP 4.1 Server软件预测显示A29L蛋白无信号肽(图3),使用TMHMM-2.0预测蛋无跨膜区(图4)。根据NetPhos 3.1软件预测，A29L蛋白包含10个磷酸化位点，具有2个丝氨酸磷酸化位点、8个苏氨酸磷酸位点(图5)。

图2 A29L蛋白亲水性分析

图3 A29L蛋白信号肽预测

图4 A29L蛋白跨膜区预测

4 A29L蛋白的二、三级结构

利用SOPMA预测A29L蛋白二级结构(图6),其中包含63个(57.27%)α-螺旋(Hh),10个(9.09%)伸展链(Ee),1个(0.91%)β-转角(Tt),36个(32.73%)无规卷曲(Cc)。使用SWISS MODEL软件对A29L蛋白三级结构模型构建(图7)。

图5 A29L蛋白磷酸化位点预测

图6 A29L蛋白二级结构

图7 A29L蛋白三级结构

5 A29L蛋白的抗原表位

利用ABCpred软件，预测A29L蛋白含有11个B细胞抗原表位，分数>0.5(分数为0-1)。利用SYFPEITHI软件预测有6个CTL细胞抗原表位，MHC类型为HLA-A*02∶01,得分≥21分(表2);10个Th细胞表位，MHC类型为HLA-DRB1*0401,得分≥20分(表3)。

表2 A29L蛋白HLA-A*02∶01限制性CTL抗原表位预测

表3 A29L蛋白HLA-DRB1*0401 Th抗原表位预测

6 A29L同源蛋白分析

运用BLAST分析A29L蛋白的氨基酸序列，有8个同源性较高的蛋白。其中牛痘病毒CPXV162蛋白和牛痘病毒A27L蛋白与猴痘病毒的A29L同源性高。同源性分别是95.45%和94.55%(图8)。

图8预测A29L蛋白同源性

3、讨论

与其他需要在细胞核中复制的DNA病毒不同，猴痘病毒可以将自身复制所需的蛋白质在细胞质中表达出来，所以能在细胞质中完整地完成复制循环[13]。猴痘病毒复制过程中会产生两种具有传染性的病毒颗粒：细胞内成熟病毒IMV和细胞外包膜病毒(Extracellular enveloped virion, EEV),IMV在宿主细胞胞质中组装，形成单层膜；EEV在高尔基体被加工成双层膜。IMV通过细胞裂解后释放，主要介导不同宿主间传播[16]。目前疫苗的研究主要集中在一些具有免疫原性的蛋白。如具有保护免疫原性的成熟病毒粒子表面蛋白L1、A27、D8、H3和囊膜病毒粒子的表面蛋白B5和A33[17]。A27蛋白是三种糖胺聚糖(Glycosaminoglycan, GAG)粘附分子之一，与硫酸乙酰肝素特异性结合附着在细胞表面，对于胞内病毒进入宿主细胞起重要作用[18]。因此该蛋白是病毒中和的靶标，已有研究表明猴痘病毒的A29L蛋白和牛痘病毒的A27蛋白与肝素结合的亲和力相似，且两种蛋白的同源性很高[19],因此我们推测猴痘A29L蛋白可以作为中和抗体的关键靶点。正痘病毒通常每年仅有1～2个核苷酸位点突变，但目前的猴痘病毒已有46个位点变异，这极大增加了研发猴痘疫苗的难度[20]。对比突变位点(表4),A29L基因不存在突变，这表明可以针对A29L开发广谱抗病毒阻断药与疫苗。

表4猴痘病毒突变位点

本研究利用生物信息学方法，以猴痘病毒的A29L蛋白为对象，对其结构和功能进行预测。利用ProtParam、SignalP 4.1、TMHMM-2.0、NetPhos 3.1 Sever、SOPMA、SWISS-MODEL、ABCpred、SYFPEITHI、BLAST等在线分析工具，分析猴痘病毒A29L蛋白的理化性质、信号肽、跨膜区、磷酸化位点、二三级结构、抗原表位、蛋白同源性等。结果显示，A29L蛋白相对分子质量为12.55 924×103,等电点7.89,是稳定亲水性蛋白。跨膜区软件显示该蛋白没有跨膜区段，且都在猴痘病毒膜外侧。SignalP 4.1 Server软件显示A29L蛋白无信号肽，说明该蛋白并非分泌蛋白。A29L蛋白有10个磷酸化修饰点，显示A29L蛋白可能受磷酸化调控。二级结构中有较多的ɑ-螺旋和无规则卷曲，显示出较好抗体嵌合性。ABCpred预测含有得分>0.5的B细胞表位11个，SYFPEITHI预测≥21分以上的CTL细胞表位有6个，≥20的Th细胞表位有10个，可作为猴痘疫苗候选抗原。通过BLAST分析，A29L蛋白与牛痘病毒的A27蛋白同源性很高，表明A29L可以作为疫苗的候选蛋白。

当前猴痘病毒在全球肆虐，现有的疫苗和药物存在一定的不足，开发针对猴痘的疫苗和药物刻不容缓[21,22,23]。A29L蛋白作为促进病毒包膜融合蛋白，在病毒与细胞融合过程中发挥重要的作用，但与其他包膜蛋白A35、H3L、E8L等蛋白的相互作用机制尚不清楚。本研究通过生物信息学分析A29L蛋白的性质和功能，为建立猴痘疫苗和治疗药物研发提供了理论基础。

参考文献:

[3]姜婷婷,陈祥生.全球猴痘流行状况及趋势[J].中国麻风皮肤病杂志,2023,39(7):535-537.

[9]马丽丽,蒋涛,赵晏强,等.全球猴痘病毒知识图谱和多维主题分析研究[J].病毒学报,2022,38(5):1069-1079.

[17]吕诗韵,卢佳,李新国,等.猴痘病毒及其疫苗的研究进展[J].中国生物制品学杂志,2022,35(12):1409-1413.

[20]苏琳佳,许方婧伟,张云涛.猴痘病毒疫苗的研究进展[J].微生物学免疫学进展,2022,50(5):1-5.

[21]王毅豪,刘承锐,刘昊霖,等.猴痘F3L蛋白的表达､纯化及多克隆抗体制备[J].中国病原生物学杂志,2023,18(11):1274-1278.

[22]王道,刘文彬,宋甜.猴痘病毒相关蛋白A42R的生物信息学及分子对接分析[J].中国病原生物学杂志,2024,19(1):1-9.

基金资助:国家自然科学基金(No.81902170);

文章来源:张郁勃,葛萧,沈方园,等.猴痘病毒A29L蛋白的生物信息学分析[J].中国病原生物学杂志,2024,19(04):373-377.