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预防传染病mRNA疫苗成品质量控制要点分析

2024-05-24 11 上传者：管理员

摘要：mRNA疫苗已经开发近30年，但由于生产环节、稳定性和反应原性存在一定的技术瓶颈，导致mRNA疫苗发展较为缓慢。如今，基于预防COVID-19的mRNA疫苗的应用，充分验证了预防传染病mRNA疫苗的有效性和安全性。本文通过梳理WHO及药品监管和标准化机构关于预防传染病mRNA疫苗成品质控的指导文件，总结归纳预防传染病mRNA疫苗成品关键质量控制属性及相关要求，旨在为中国预防传染病mRNA疫苗质量控制提供参考。

关键词：
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WHO
传染病
疫苗
质量控制
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mRNA(信使核糖核酸)由DNA模板转录而来，携带遗传信息，指导细胞生产胞内蛋白、膜蛋白及胞外蛋白。mRNA 疫苗的核心原理是将编码抗原的mRNA通过不同的递送方式递送到机体组织细胞内，在细胞内翻译后产生相应的抗原蛋白，从而有效激起生物体产生特异性免疫反应并获得免疫保护的一种新型疫苗。与传统的灭活、减毒疫苗或基因工程疫苗相比，mRNA疫苗具有如下优点：研发周期短，生产工艺简单、扩产容易，无需佐剂、有效性高，不进入细胞核、安全性较好等。与DNA疫苗相比，mRNA疫苗直接在细胞质中发挥其功能，既不依赖于运输机制，也不依赖于细胞转录机制，所以起效更快，效果更强。尽管mRNA疫苗在1990年初期首次进行了测试，但由于疫苗稳定性较脆弱，故而最初并未得到广泛使用。Ross等[1]于1995年发表了关于通过优化和配制可以提高 mRNA稳定性的初步证明，从那时起，对mRNA疫苗的研究呈爆炸式增长。如今，抗SARS-Cov-2 mRNA疫苗的有效性和安全性在新冠疫情大规模爆发中得到了充分证明，mRNA疫苗技术被推到了新兴疗法的前沿。但是，mRNA疫苗的生产过程中所涉及的分子结构设计、递送系统的优化、生产工艺放大等诸多环节，仍有很多技术壁垒或者工艺难点急需解决。本文通过梳理WHO于2021年发布的《预防传染病mRNA疫苗质量、安全及有效性评价法规考虑要点》[3],旨在探讨预防传染病mRNA疫苗成品质量的控制要点。

1、mRNA疫苗质量控制相关法规和指南

目前，除新冠mRNA疫苗外，其他传染病的预防性mRNA疫苗和肿瘤治疗性mRNA疫苗也是研究热点之一。mRNA疫苗的快速发展为该类疫苗的质量控制提出了新的挑战。2006年，欧盟颁布了临床试验用药申报资料(Investigational Medicinal Product Dossier, IMPD)文件，指出了mRNA疫苗关键质量属性，包括mRNA完整性、含量、效价[4]。2020年，国家药品监督管理局药品审评中心颁布了《新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则(试行)》[5],对mRNA疫苗模板设计、质粒构建、生产工艺、制剂处方、质量特性及标准制定、稳定性研究、申报临床阶段等方面提出技术指导。2021年，WHO颁布指南文件《预防传染病mRNA疫苗质量、安全及有效性评价法规考虑要点》[3],指出mRNA疫苗考察指标包括外观、mRNA含量、疫苗效价、mRNA完整性、包封率、粒径、分散性以及与mRNA和脂质相关的杂质。

mRNA疫苗包含脂质体和核酸两部分结构，关于脂质体药物的关键质量属性可以参考2018年美国FDA发布的《脂质体药物CMC、人体药动学和生物等效性研究以及标签管理》行业指南[6],文中指出脂质体药物的关键质量属性，包括粒径大小、粒径分布和形态学特征等。

2、WHO指南文件对mRNA成品疫苗的质量控制

由于mRNA的分子量大(104～106)、带负电荷且易于被核酸酶降解，因此，很难通过细胞膜的磷脂双层。近年来，已开发出用于mRNA封装的各种运载工具，包括脂质纳米颗粒(lipid nanoparticle, LNP)、聚合物纳米颗粒、脂聚复合物 (Lipopolyplex, LPP) 和阳离子多肽等[7]。脂质及其衍生物被认为是1种新型的mRNA疫苗递送系统，由于其低免疫原性、生物相容性和高包封率而备受关注。大多数mRNA常用脂质纳米颗粒(LNP)作为传递系统，LNP通常包括可电离脂质、胆固醇、辅助脂质和聚乙二醇化脂质4大部分，一起封装和保护脆弱的mRNA核心。LNP封装直接关系到mRNA疫苗的最终质量，特别是涉及靶基因序列设计、原材料、mRNA 纯度和完整性，以及载药量mRNA-LNP制剂的制备，一般采用冲击式射流混合法、微流控混合法等技术，将mRNA原液和LNP按一定比例精确混合，形成粒径均一的包裹mRNA的纳米脂质体，经超滤换液等步骤，去除杂质后制成mRNA-LNP制剂中间产物。在该过程中，必须通过测量平均粒径、粒径分布、mRNA含量、封装效率和无菌性来仔细检查mRNA-LNP中间产物[8]。最后，将获得的mRNA疫苗制剂进一步进行无菌过滤和灌装的最终加工。由于mRNA-LNP的大小、多分散性和稳定性，会同时受到生产中脂质和水相的流体动力学和剪切应力的影响，因此，配制mRNA-LNP的关键工艺参数和操作空间，以及疫苗的稳定性都应进行充分研究。

LNP不稳定并且易于降解，主要的降解途径是由于暴露于光、氧气、金属残留物和高温而导致的氧化。不饱和烷基链与聚环氧乙烷或聚环氧丙烷基团是LNP氧化的潜在底物。聚乙二醇化(PEG)脂质在空间上保护 LNP 不与其他脂质颗粒或血液成分相互作用，从而降低LNP自聚集、调理作用或吞噬作用，但它是氢过氧化物的潜在来源。氢过氧化物通常不稳定，分解会导致链式反应，从而催化可电离脂质的降解。这些脂质降解中的一些产物可能与mRNA反应，形成共价mRNA脂质加合物，或诱导其他可使mRNA 降解的反应，因此，氢过氧化物是一种可疑的降解源，可以直接或间接地破坏 mRNA。另外，含有酯键的脂质会因脂质化学结构、pH、温度和缓冲液组成而被水解，从而影响LNP的结构完整性，因此，应评估每个批次成品疫苗的递送系统成分产生的潜在杂质，以及控制成品中因氧化和降解产生的杂质。通常单次检测不足以检测出所有潜在的杂质，需要考虑对mRNA完整性、颗粒大小、脂质/聚合物杂质和包裹在LNP中的mRNA比例/效率进行检测。而关于容器和胶塞的匹配性、溶出物和萃取物的评估，也应在申请上市许可时一并提交。除此之外，也应对结构性递送系统(如纳米颗粒)的物理和化学属性进行特性研究，以解决递送系统和成品制剂的一致性和稳定性等问题，同时还应考虑到脂质的质量和制剂的关键质量属性。此外，对mRNA-LNP及其在目标细胞中的摄取进行充分特性研究，包括了解合成mRNA-LNP的表面化学、大小、多分散性、形状、电荷和蛋白质结合特性，以确保对mRNA的充分保护和疫苗达到必要稳定性[3]。

研究表明，mRNA极易被无处不在的核糖核酸酶(RNase)降解，因此，建议超低温储存以限制RNase活性，有效地保护mRNA稳定性。此外，超低温保存也更有利于保持mRNA-LNP复合物的原有构象[13]。事实上，尽管目前用于 mRNA疫苗的递送系统是基于LNP,但疫苗制造商的储存条件和稳定性各不相同。例如，Moderna的mRNA-1273 疫苗在-20 ℃下可保持6个月的有效性， BioNTech的BNT162b2疫苗在-60～-80 ℃的温度下可保持6个月的有效性，CureVac的CVnCoV疫苗可以在-60 ℃下储存3个月。因此，应考虑对冷链运输和储存条件进行适当验证，以确保mRNA疫苗的质量。

3、检测项目及优化

无论是在水溶液中作为药物成分还是在LNP中配制(或提取)作为药物产品，mRNA的分子大小、物理和化学性质都给检测方法提出了挑战。针对mRNA、脂质体和制剂的特性以及相关杂质等mRNA疫苗关键质量属性，研发机构应建立检测方法。表1总结了现有的mRNA原料药和mRNA成品的检测方法[16]。2021年颁布的美国药典通则<1220>,将生命周期管理理念应用到检测方法中，使方法设计、确认、转移和验证活动整合到检测方法生命周期过程中，并将其视为1个连续动态而非割裂的不同独立阶段的活动，以提升分析方法的质量水平[16]。ICHQ2(R2)[19]及Q14 [20]征求意见稿进一步明确了对检测方法建立和验证的技术要求。

表1 mRNA原料药和mRNA成品的检测方法

4、结语

近年来，mRNA疫苗在全球迅速崛起，其在服务全球公众健康领域有着无限潜力。安全有效的预防传染病的mRNA疫苗有望在应对突发公共卫生事件的传染病防治中发挥重要作用。疫苗作为预防性生物制品，其成品质量控制尤为重要，希望在不久的将来，可将mRNA疫苗的产品质量与临床、非临床研究相联系，从而确保mRNA疫苗的安全性和有效性；并在利益相关方之间就mRNA疫苗的技术规范达成国际共识，以确保疫苗的质量、安全性和疗效。

文章来源:孙巍,佟乐,杨亚莉,等.预防传染病mRNA疫苗成品质量控制要点分析[J].药物分析杂志,2024,44(05):912-915.