重症肺炎是入住重症监护病房(intensivecareunit,ICU)及老年患者死亡最重要原因之一,病死率30%～50%[1]。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)是引起医院获得性肺炎(hospitalacquiredpneumonia,HAP)的主要病原菌之一,由于耐药菌株不断产生,临床上常用万古霉素进行治疗[2,3]。近年来,万古霉素治疗MRSA引起的重症肺炎等疾病的有效性受到质疑。抗菌药物能达到感染组织部位的实际浓度,抗菌清除效果及临床疗效都有着决定性的关系。对于肺部感染,抗菌药物在肺泡上皮衬液(epithelialliningfluid,ELF)中是否能够达到有效的浓度,影响着其实际的临床疗效及患者的病情转归。越来越多研究开始关注治疗过程中靶组织的药物浓度,并尝试通过测定感染部位的实际药物浓度,优化抗菌药物的给药方案、预测临床疗效,以实现个体化的精准药物治疗,最终达到精准医疗的目的。笔者在本研究选取入住ICU诊断为肺部感染、采用机械通气同时使用万古霉素治疗的重症患者,通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法,测定患者用药后支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,BALF)中药物浓度,根据RENNARD等[4]所建立的尿素稀释法,计算ELF中实际药物浓度,并与同期血药浓度进行对比,以探究万古霉素在肺部组织的渗透性,为临床上使用万古霉素进行肺部感染治疗的给药方案调整提供支持依据。

1、资料与方法

1.1临床资料

2016年5月—2017年1月,入住南京医科大学第一附属医院老年ICU患者。患者需符合所有入选标准,并且不符合任何一条排除标准。入选标准:①确诊肺部感染;②如培养出敏感菌或经验性治疗需要使用万古霉素;③急性生理及慢性健康(APACHEII)评分>15分;④气管插管或气管切开,使用呼吸机进行辅助呼吸;⑤需要进行支气管镜检、肺泡灌洗或相应治疗;⑥病程中有明确的病原分离及药敏结果。排除标准:①年龄<18岁;②急性或慢性肾衰竭,肌酐清除率(ClCr)<40mL·min-1;③用药期间进行血浆置换或体外膜肺氧合(extracorporealmembraneoxygenation,ECMO)或持续性肾脏替代治疗(continuousrenalreplacementtherapy,CRRT)患者;④孕妇或正在哺乳的妇女、烧伤以及囊性纤维病患者;⑤由于治疗无效或发生严重药物不良反应导致中途停药的患者;⑥癫■或患有精神系统疾病的患者;⑦对万古霉素或其他糖肽类药物具有过敏史的患者;⑧获得性人免疫缺陷病毒(HIV)感染或有其他严重传染性疾病的患者。

1.2治疗方法

治疗药物:注射用盐酸万古霉素(商品名:稳可信,EliLilly&Co,注册证号:H20030375,规格:每瓶500mg)。给药方法:万古霉素0.5g,溶于0.9%氯化钠注射液100mL,q8h,所有患者均采用自动输液泵进行给药,给药维持时间为1h持续泵入,给药前对输液泵进行校准以确保所有药液在1h内准确输注完毕。同时记录患者用药时间,给药开始以及结束时间,所用万古霉素的产品批号。

1.3样本及患者信息采集

样本采集:选取符合入选标准患者,于使用万古霉素第3天,不同患者分别于一个给药间隔内某个时间点(给药开始后1,1.5,2.5,4.5,7.5h)进行支气管肺泡灌洗及血样采集。灌洗操作参考THOMAS等[5]方法:将纤维支气管镜从气管插管患者的插管接口处进入,下至右肺中叶楔段,局部给予1%利多卡因10mL麻醉,将无菌0.9%氯化钠溶液200mL分4份,每份50mL,从纤维支气管镜上端注入,立即(30s内)抽吸,回收肺泡灌洗液于痰液收集器中,并立即置于冰上。首次抽吸出50mL回收液丢弃,因其中含有临近气道的细胞、痰液及分泌物等,收集剩下3次回收的灌洗液,合并至同一容器,检测万古霉素和尿素的浓度。支气管肺泡灌洗操作的同时,抽取静脉血2mL,置于黄色促凝采血管中,检测血中万古霉素和尿素的浓度。

患者信息采集:分别记录患者的姓名、性别、年龄、身高、体质量、体质量指数(BMI)、肝肾功能、APACHEII评分、临床肺部感染(CPIS评分)、入院及出院诊断等一般人口学资料。并记录患者合并的基础疾病、合并用药、用药时间、住院时间等。记录患者除肺部感染之外有无合并其他感染、急慢性肝肾功能衰竭等。记录有无药物不良反应发生、并统计用药前后患者的白细胞计数(WBC)、中性粒细胞百分比(N%)、C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)等感染指标,对用药期间所做的细菌培养及药敏试验结果进行记录。

1.4浓度测定及计算方法

1.4.1万古霉素在血浆和肺泡灌洗液中浓度测定

采用LC-MS/MS法进行检测,采用ThermoHypersilGOLDC18(100mm×2.1mm,3μm)色谱柱,流动相为甲醇-水(含0.1%甲酸)进行梯度洗脱,流速:300μL·min-1,柱温:25℃,保留时间:6.5min;质谱检测离子源为ESI+电喷雾,检测方法:正离子模式,扫描方法:多反应监测(multiplereactionmonitoring,MRM),离子通道设定为万古霉素m/z725.5→144.1,甲氨蝶呤(MTX,内标)m/z455.2→308.2,毛细管电压:4000V,气流温度:350℃,气流流速:9L·min-1,电喷雾压力:35psi[5]。

1.4.2尿素在血浆和肺泡灌洗液中浓度测定

尿素的测定参考文献[6,7]方法,使用尿素测定试剂盒,利用尿素酶-谷氨酸脱氢酶法[8],尿素在脲酶的作用下水解产生氨离子和二氧化碳,氨离子在碱性介质中与酚显色剂生成蓝色的物质,该物质的生成量与尿素含量成正比,在波长640nm比色测定。

1.4.3万古霉素在ELF中浓度计算

根据RENNARD等[4]所建立方法,通过纤维支气管镜进行支气管肺泡灌洗,所获得的肺泡灌洗液实际上是0.9%氯化钠溶液稀释的ELF。而尿素作为一种非极性的小分子,可以自由通过肺泡壁,由此认为尿素在血液和ELF中浓度是相似的,那么就可以通过测定血中的尿素浓度,以及BALF中尿素浓度,以此作为稀释倍数,计算ELF中实际的药物浓度。

VELF=VBALF×[U]BALF/[U]ELF(1)

其中VELF为ELF的体积,VBALF为BALF的体积,[U]BALF为BALF中尿素浓度,[U]ELF为ELF中尿素浓度。

ELF中药物浓度([D]ELF)计算如下:

[D]ELF=[D]BALF×(VBALF/VELF)(2)

其中,[D]BALF是BALF中药物浓度,将(1)代入(2)可得:[D]ELF=[D]BALF×([U]ELF/[U]BALF)。因此,测定肺泡灌洗时血液中和回收BALF中尿素浓度,以及BALF中药物浓度即可根据尿素稀释倍比关系计算ELF中药物的实际浓度。

1.5渗透性计算

万古霉素对肺组织的渗透性,以药物在ELF中浓度与血液中药物浓度比值表示。

1.6统计学方法

采用SPSS19.0版软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(x¯±s)表示,患者疗效分析采用t检验和Wilcoxon检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1患者基本信息

本研究共收集符合入选标准患者19例,剔除患者3例,其中1例为使用万古霉素<3d即停药换用其他抗菌药物,1例家属拒绝签订知情同意书,1例肾功能不全(ClCr=32mL·min-1)。最终收集符合纳入条件患者16例。所有患者均接受万古霉素0.5g,q8h的方法给药。入组患者平均年龄(60.94±15.95)岁,平均体质量(71.77±7.59)kg,平均BMI偏高,为(25.20±3.11)kg·(m2)-1。诊断均为肺部感染,部分患者合并血流感染或腹腔感染等。APACHEⅡ评分平均为(30.31±4.47)分。纳入的16例患者中,用药前肾功能正常10例,其中ClCr>150mL·min-1的4例,肾功能受损6例。住院期间死亡2例,主要死亡原因为多器官功能障碍综合征。所有患者入科最初24h的人口统计学资料及临床资料见表1。

2.2临床感染相关指标

16例患者用药前后感染指标见表2。用药后患者感染指标均有所下降,结果表明,白细胞计数和PCT的下降差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3微生物学结果

入组患者用药期间细菌培养结果见表3。培养来源均为痰液或肺泡灌洗液,标本采集方式为使用吸痰管经气道吸引,或使用纤维支气管镜经肺泡灌洗收集,标本采集时间为万古霉素使用后1～3d内,共检出菌株43株,其中革兰阴性菌为25株,占58.1%。鲍曼不动杆菌为最常见的菌株,占18.6%。其次为肺炎克雷伯菌(14.1%)、金黄色葡萄球菌(11.6%)和铜绿假单胞菌(11.6%)。所有检出菌株中,对万古霉素敏感的菌株13株(13例患者),其中金黄色葡萄球菌5株,凝固酶阴性葡萄球菌3株(未行菌种鉴定),头状葡萄球菌2株,及人葡萄球菌、表皮葡萄球菌、伊丽莎白金菌各1株(纳入其他类)。有3例患者无病原学结果,为经验性使用万古霉素进行治疗。

2.4药物在肺组织的渗透性结果

支气管肺泡灌洗的样本采集结果及药物浓度测定结果见表4。灌洗时回收灌洗液体积平均为58.25mL,回收率27%～46%。肺泡灌洗的时间点分布在整个给药间隔内,其中给药开始后1h采样2例,1.5h采样4例,2.5h采样4例,4.5h采样4例,7.5h采样2例。不同时间点灌洗液浓度及灌洗液药物浓度-时间曲线见图1。灌洗液中万古霉素浓度43.86～359.16ng·mL-1,其浓度变化趋势与血药浓度变化趋势,经Spearman相关性检验,P=0.001(小于0.05),变化趋势具有相关性。尿素在灌洗液中的稀释倍数约37.34倍,利用Renard公式计算ELF中万古霉素的浓度1.48～10.15μg·mL-1,低于血药浓度,其渗透率为8.4%～47.13%,平均为23.12%,与类似研究的结果基本一致[5,10,14]。4例肾功能亢进(ClCr>150mL·min-1)患者的渗透率(18.89±2.73)%,其他患者(24.54±11.02)%,比较差异无统计学意义(P>0.05),2例死亡患者的渗透率(18.19±3.23)%,与存活患者的渗透率(23.83±10.33)%比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

表116例患者基本资料

表216例患者用药前后感染指标变化

表3微生物学结果

3、讨论

传统的抗感染药物治疗通常关注血药浓度和微生物二者之间的关系,随着精准药物治疗的推广,越来越多研究发现药物在靶组织达到的实际浓度较血药浓度更有治疗意义。与血药浓度比较,感染的治疗效果与抗菌药物在感染组织部位的实际浓度更为相关,而且大多数药物浓度检测基本上都是通过血药浓度来推测组织浓度,没有具体的组织浓度检测值推荐。对于肺部感染来说,胞外病原菌主要存在于ELF中[1],抗菌药物在此处聚集的浓度决定抗感染治疗的效果,因此,近年来研究开始对药物在ELF中的浓度进行测定,一方面是为了解药物对肺组织的渗透性,另一方面探讨肺部组织浓度与临床治疗效果的相关性,用以优化现有的抗菌药物方案。万古霉素已经上市50多年,尽管对其临床应用的研究众多,但大部分为不同病理生理状态下血药浓度的测定和群体药动学分析,而对于肺组织的渗透性研究,以及肺组织药物浓度与临床疗效相关性的研究很少。

表416例患者的灌洗液药物浓度测定结果

图1不同时间点血药-灌洗液药物浓度

支气管肺泡灌洗可以通过注入0.9%氯化钠溶液抽吸回收的方法,间接获得稀释的ELF,是临床较为安全、方便的获得ELF的方法。目前尚未建立公认的肺泡灌洗采样的支气管镜检和灌洗标准操作规程,本研究中的肺泡灌洗操作参考大量以往的研究并结合ICU临床经验,给予无菌0.9%氯化钠溶液200mL分4次注入灌洗,首次50mL丢弃,且均由ICU同一医师进行操作,减少由个体间差异导致的系统误差。灌洗液在肺内停留时间参考先前的各项研究[5,10,11],选择注入0.9%氯化钠溶液后立即(30s之内)抽吸出,计算得ELF的稀释倍数为17.8～79,与先前的研究基本一致。研究表明不同的停留时间,可自由扩散的小分子物质被不同程度地稀释,导致回收的灌洗液中尿素浓度受到影响,立即抽吸可尽量减少自由扩散带来的误差。通过支气管肺泡灌洗获得样本的操作受到很多因素的影响,首先应保证患者给药方法保持一致,本研究均采用输液泵,60min持续静脉泵入,于采样前30min内做好肺泡灌洗准备工作,以确保在准确的时间点获得样本。样本采集的操作标准和人员始终保持一致,以减少误差。

很多研究对临床常用的抗菌药物对肺部渗透性进行测定,给药方法包括口服和静脉滴注,目标人群通常为健康志愿者或普通患者。总体来说,对于β-内酰胺类、糖肽类药物,其对肺组织的渗透率<100%,临床使用时需要根据血药浓度估算组织部位实际到达浓度,并结合PK/PD参数、敏感菌的最低抑制浓度(MIC)等综合考虑调整给药方案;而对于喹诺酮类、利奈唑胺等,其肺组织中药物浓度通常能达到血药浓度的几倍甚至几十倍(渗透率>100%),这类药物更多地聚集在肺组织,能起到较好的抗菌效应,但对血流感染仍需根据实际情况进行调整。

对严重肺损伤患者进行药物对肺部组织穿透性的研究发现,静脉给予万古霉素后测得肺组织内实际药物浓度要低于血清中的药物浓度[2,3]。对10例上呼吸机重症肺炎患者给予常规剂量万古霉素30mg·kg-1,每天1次,于给药后24h测定血清药物浓度及谷浓度下的ELF中药物浓度[4],结果显示,10例患者中4例血清药物浓度>20mg·mL-1,其ELF中可以检测到万古霉素。这些研究都显示万古霉素对肺部的渗透性较小,对肺组织部位药物浓度进行检测,能够帮助医生了解其实际感染部位能够达到的药物浓度,从而根据药物的PK/PD特点来优化给药方案,使感染部位的组织浓度达到有效治疗范围内,以获得更好的临床疗效。

本研究中,万古霉素在ELF中的浓度在一个给药间隔内范围为1.48～10.15μg·mL-1,灌洗同时血药浓度为8.71～61.96μg·mL-1,平均渗透率为23.12%,渗透率较低。LODISE等[5]针对于10名健康志愿者测定其ELF中万古霉素的浓度,静脉给药万古霉素1g,q12h,给药9次后进行肺泡灌洗并测定ELF药物浓度,结果表明万古霉素在ELF的渗透率为41%。LAMER等[10]研究纳入进行机械通气重症患者14例,测得的ELF渗透率为18%。可见重症患者对药物的体内过程,受疾病严重程度、器官功能状态、白蛋白水平、合并症等而千差万别。此外,笔者对肾功能亢进患者与其他患者渗透率进行比较,结果差异无统计学意义,2例死亡患者与存活患者渗透率比较也差异无统计学意义,但由于本研究纳入例数较少,此结果仅作为参考。

从本研究来看,万古霉素肺组织渗透率低,在肺部感染患者,其ELF中药物浓度可能不能满足治疗所需,制定治疗方案的时候要根据万古霉素的PK/PD特点,一是保证给予足够的剂量,二是可以将给药间隔由q12h调整为q8h甚至q6h。如果万古霉素血药浓度已达标但临床效果未有改善时,尤其是当目标细菌MIC值较高的时候,应当考虑可能肺组织浓度不足所致,此时万古霉素非最佳选择。

由于涉及ICU患者以及特殊的采样方式,本研究存在一些缺陷,如入组例数少,采样时间受限,某些关键指标(器官功能、白蛋白水平、合并用药等)基线不能充分匹配等。药物对肺组织的渗透性与很多因素有关,其中比较重要的是血浆蛋白结合率,因为游离的药物更加容易透过组织屏障,进入感染部位。万古霉素为大分子,并非高蛋白结合率药物,蛋白结合率约为50%,因此本研究设计中未考虑蛋白结合率变化的影响,所测定的血清、灌洗液药物浓度均为总的药物浓度(包括游离药物和蛋白结合的药物)。本研究对血清药物及ELF药物浓度进行分析,其随时间变化趋势具有一定的相关性,药物在血液中PK过程与在ELF中PK过程类似。由于药物蛋白结合率为浓度依赖性,因此药物体内各部位的浓度也有很大差异,后续可以考虑蛋白结合率的影响,对药物在血清、ELF中的PK特点进一步研究。

本研究纳入16例患者,初步对万古霉素在此类人群中的肺部渗透性进行研究,后期将收集更多患者,并细化入选标准,以获得更具针对性的数据支持。

参考文献：

[1]中国医师协会急诊医师分会.中国急诊重症肺炎临床实践专家共识[J].中国急救医学,2016,36(2):97-107.

孙尧,傅源源,周苏明,罗璨.重症肺部感染患者肺泡上皮衬液万古霉素渗透性研究[J].医药导报,2021,40(02):204-209.