工业革命以来，人类活动所排放的CO2急剧增加。海洋是地球生态系统最重要的碳汇，通过表层水—气交换吸收大气中约1/3的CO2来调节不断增加的CO2浓度。然而，大量CO2溶解到海水中，改变了海水的碳化学体系，导致海水pH值降低、CO32-浓度及碳酸盐(碳酸钙)饱和状态降低，引起海洋酸化(Orretal.,2005)。同时，大量的CO2和其他温室气体可以将热量吸收并重新发射辐射至地表，导致海水温度不断升高(Hauganetal.,1996)，称之为海洋变暖(Bijmaetal.,2013)。据模型预测，到本世纪末海水表面pH预计下降0.3～0.4个单位，海水温度将上升1.5～2℃。

海水酸化通过改变酸碱平衡对海洋生物造成直接影响。海水酸化导致CO32-处于不饱和状态，钙化生物骨骼CaCO3饱和度降低，从而增加生物体内血碳酸含量，同时降低海洋生物钙化率。因此，海水酸化对钙化生物的影响尤为显著，已有研究表明海水酸化对马氏珠母贝幼虫、海胆、海蛇尾等的生长发育有显著影响。同时，温度是直接影响生物生理生态及行为学最普遍的因子，也决定了物种的地理分布，因此海洋变暖会造成物种入侵，已发现热带地区双壳贝类有向高纬度地区迁移的趋势。然而无脊椎动物受温度变化的影响更为广泛，尤其是其早期生活史阶段。

棘皮动物大都是钙化生物，但代谢能力和调节能力较弱，是研究气候变化的指示生物之一。尽管物种之间存在差异，但研究者普遍认为，棘皮动物幼虫对海洋环境变化极为敏感。当前，国内外对棘皮动物响应气候变化的研究主要聚焦于海胆纲、海星纲和海蛇尾纲，而对海参纲动物的影响主要考虑单一因素胁迫后的生理效应，如海水酸化对幼虫形态发育及成体能量收支和生理代谢的影响(Yuanetal.,2016)。刺参是我国北方沿海典型的经济种类，海洋酸化和海水升温两者交互作用对刺参早期发育的影响尚未见报道。刺参幼虫在一系列浮游阶段后，大约在受精20天后变态附着进入底栖生活阶段，发育至稚参。稚参是海参生活史中关键的一环，这一时期海参幼体刚刚进入底栖生活阶段，并完成体色变化、骨片发育和管足形成等重要形态变化过程(邱天龙，2013)。

基于IPCC(2013)对本世纪末海水pH和温度预测值，本文研究了海洋酸化和升温对刺参稚参生长和发育的影响，旨在揭示刺参稚参对海洋酸化和海水升温的生理生态响应和适应性，为评估海洋酸化及变暖对海参类棘皮动物及其依存生态系统的影响提供科学依据。

1、材料与方法

1.1实验材料

本研究所用实验对象为受精后第24天发育至小白点的稚参，个体体重(0.50±0.01)mg。稚参运回生态环境部近岸海域重点实验室暂养7天后转入不同实验条件的培养箱中进行实验。

1.2研究方法

1.2.1实验设置

利用人工气候培养箱(HP400G-D型)进行CO2加富和升温。利用CO2分压探头及温度调节器控制并改变培养箱中CO2浓度和温度模拟当前和本世纪末海洋酸化及变暖场景。实验设置对照组(大连近海海水温度，pCO2400mg·kg-1)、升温组(对组温度+2℃，pCO2400mg·kg-1)、酸化组(对照组温度，pCO21000mg·kg-1)、酸化升温组(对照组温度+2℃，pCO21000mg·kg-1)4个实验处理，分别代表本世纪末pH下降0.3～0.4，温度升高2℃(Caldeiraetal.,2003;IPCC,2013)。实验进行72d，实验过程中，每日从国家海洋环境预报中心官方网站查询大连近海海水温度，根据实际温度的变化对实验温度进行调节，每次水温调节不超过0.5℃。

海水环境要素和无机碳化学参数测定和计算如下:温度、pH通过FIVEGOTMpH计(准确率0.001)测定;盐度、溶解氧等通过YSI多参数水质仪(YSI6600v,USA)测定。海水总碱度(Totalalkanity,TA)通过AS-ALK2总碱度滴定系统(准确率2μmol·L-1)测定。实验开始后每日测定温度和pH，每6天测定一次总碱度、盐度、利用CO2SYS软件计算碳酸钙饱和度(ΩCa)、文石饱和度(Ωar)和二氧化碳分压(pCO2)(Lewisetal.,1998)。

1.2.2稚参培养

每个人工气候培养箱作为1个实验组，利用人工气候培养箱内的4层隔板各放置1个容积为32L的玻璃水缸，设置4个平行。每个水缸底部放置4块聚乙烯波纹板(10cm×15cm)作为附着基，波纹板底部用干净的石块垫高，便于换水时抽取残饵和粪便。每块波纹板上刺参幼体数量约为40～50头，培养稚参所用海水为砂滤海水，每日换水1/3～1/2以保证水质清洁。每缸1个气石，24h持续充气。

1.2.3体重测量

将实验起始日记为第1天，每隔20天从各水缸中取一块波纹板，随机选取40头稚参，用80%氯化镁麻醉40min，之后用10%福尔马林固定。体视显微镜(LEICAM165C)下观察其发育形态、体色，测量其体重。

1.2.4生长率、体重变异系数

稚参生长以特定生长速率来表示，计算公式如下(Zhangetal.,2015):

其中W0为起始体重，Wt为终末体重，T为发育时间。

体重的变异系数可以反映同一条件下各个个体之间体重的差异，公式如下(Qiuetal.,2014):

式中，SD为稚参体重的标准差，X为稚参体重的平均值，CVi为起始变异系数，CVf为终末变异系数。

1.2.5体色

采用Zamora等(2017)研究稚参体色变化的方法，将稚参体色变化分为7个阶段，从PS-1到PS-7，稚参体色逐渐变黑。统计各体色阶段稚参个数，计算各阶段占比。

1.2.6发育周期统计

各实验组稚参在体色变化

7个阶段中每个阶段的发育天数。

1.3数据分析

用SPSS(19.0)软件对数据进行统计分析，采用单因素方差分析(ANOVA)对稚参体长、体重、特定生长速率等的显著性差异进行检验，显著差异水平为P<0.05。

2、结果与分析

2.1实验海水环境参数和碳酸盐体系

各实验组每日海水温度和pH值测量结果如图1所示。实验起始时大连近海海水温度20.1℃，之后慢慢升高，于2019年8月22日达到峰值，为25.8℃，之后到实验结束时逐渐下降至23.8℃。对照组和酸化组的水温与大连近海海水温度基本保持了一致，变化范围为19.52～25.82℃。升温组和酸化升温组的变化趋势与对照组基本一致，但日平均温度高于对照组2.1℃(图1a)。实验海水pH总体保持稳定，对照组和升温组pH分别为8.08±0.06、8.11±0.05(变化范围8.00～8.15)，酸化和酸化升温组pH分别为7.79±0.04、7.77±0.04(7.75～7.80)(图1b)。

实验海水碳酸盐体系化学参数的测量和计算如表1所示，各实验组海水盐度(ANOVA:F3,125=6.42,P=0.389)、碱度(ANOVA:F3,153=7.751,P=0.149)无差异，但pCO2(ANOVA:F3,153=181.428,P<0.0001)、ΩCa(ANOVA:F3,153=190.355,P<0.0001)、Ωar(F3,153=203.170,P<0.0001)受实验海水pH影响而差异明显。

2.2海水酸化及升温对稚参体重的影响

稚参体重变化如图2所示。实验20天时，各实验组稚参体重已有明显差异(P<0.05)，其中升温组稚参体重最高，对照组和酸化升温组次之，酸化组最低。随后升温组稚参体重一直保持最高(P<0.05)，酸化组稚参体重显著低于其他组(P<0.05)，对照组和酸化升温组稚参体重差异不大(P>0.05)。

表1各实验组海水碳酸盐体系化学参数

注:表中数据为平均值±标准差。下同。

图1各实验组每日海水变化

注:a．各实验组每日海水温度变化，b．各实验组每日海水pH变化。

图2各实验组稚参体重变化(平均值±标准差，N=40)

注:同一实验天数不同字母表示各实验组差异显著(P<0.05)。

稚参发育过程中，各组稚参体重的标准差较大，说明稚参个体间体重差异较大。体重差异分析结果见表2。实验起始时，各组稚参体重差异系数没有明显差别。实验开始后20天，各组体重差异系数达到最大值。实验开始40天后体重差异系数相较于前20天有所减小，但升温组、酸化组和酸化升温组均高于对照组，并且有逐渐增加的趋势。对照组CV最低且呈下降趋势，实验后期ΔCV为负值。升温组CV明显高于其余条件，且ΔCV涨幅最大，即升温组稚参个体间体重差异较大，此差异也会随着稚参发育逐渐增大。酸化组和酸化升温组稚参体重差异系数略低于升温组，且逐渐增加，到实验结束时CV增加值分别达到18.77%和22.14%。

2.3海水酸化及升温对稚参生长速率的影响

如图3所示，各组稚参生长速率存在明显差异。升温组稚参SGR显著高于其余各组(P<0.05)，酸化组最低(P<0.05)，对照组和酸化升温组差异不明显(P>0.05)，其中酸化升温组SGR略低于对照组。实验进行20天后，升温组SGR仍明显高于其余3组(P<0.05)，酸化组稚参SGR最低，但酸化组和酸化升温组生长速率逐渐缩小，无明显差异(P>0.05)。

表2实验前(CVi)、实验后(CVf)稚参体重变异系数和实验期间体重变异系数的变化(ΔCV)

2.4稚参体色变化

除第一次取样时各稚参体色均为白色外，后3次取样观察发现各稚参体色均有不同程度的变化。如图4所示，相对于其余3组，酸化条件的稚参体色变化最慢，发育至43天时仍有7.4%的稚参处于PS-1阶段，到实验结束时仍有20.6%的稚参处于体色较白的阶段，只有少部分稚参体色完全变黑。升温组稚参体色发育最快，在发育至20天时部分稚参发育至PS-3阶段，其余3组还没有发育至此阶段的稚参;72天时，13.5%的稚参已经发育至PS-7阶段，其余3组未观察到发育至此阶段的稚参。对照组和酸化升温组体色发育情况相差不大，实验结束时大部分稚参体色已经完全变黑。但是，如图4所示，升温条件下仍有2.7%稚参处于体色较白的阶段，即与酸化条件下20.6%的稚参处于同一阶段。

图3各实验组稚参特定生长速率(SGR，平均值±标准差，N=40)

注:不同字母表示各实验组差异显著(P<0.05)。

图4各实验组稚参体色发育比例(N=40)

2.5发育周期

酸化和升温对稚参各阶段体色发育周期的影响见表3，体色变化第一阶段，升温组稚参仅用5天即完成，明显低于其余实验组(P<0.05);酸化组为9天，与对照组和酸化升温组没有显著差异(P>0.05)。从体色变化第二阶段开始，酸化组稚参体色变化发育周期显著长于对照组和酸化升温组(P<0.05),72天仅有5.9%稚参体色完全变黑。升温组55天即有部分半数以上稚参完成体色变黑，发育周期最短(P<0.05)。对照组和酸化升温组稚参体色变化所需天数基本相当，均在实验进行67天时大部分稚参发育至PS-7阶段。

3、讨论

全球气候变化和人类活动导致的海水酸化和升温对海洋生物，特别是钙化生物的影响加剧。棘皮动物是海洋生态系统中重要的钙化生物，其在钙化早期对海水酸化和变暖尤其敏感。Kurihara等(2004)发现，随着海水pH的降低，海胆Hemicentrotus pulcherrimus和Echinometramathaei的受精率、卵裂速度及幼虫长度随之降低。Yuan等(2015)研究了不同海水pH对刺参Apostichopusjaponicus早期发育的影响，发现随着pH的降低，幼虫的生长速率减慢，幼虫变态附着率降低。海水升温的相关研究表明，在适温范围内升高海水温度会促进海参、海胆幼体发育(Wolfeetal.,2013)。在本研究中，海水酸化导致稚参生长速率降低，体色变化迟缓，但升温能促进稚参生长发育，酸化和升温共同作用时，稚参生长速率和正常周期同对照组没有显著差异，表明海水升温可以缓解酸化对稚参发育的不利影响，这与Brennand等(2010)和Gianguzza等(2014)对海胆幼虫的研究结论一致。

表3各实验组稚参发育周期

注:同一发育阶段不同字母表示各实验组差异显著(P<0.05,N=40)。

稚参通过调节生理代谢以应对酸化和升温造成的不利影响。据报道，海水酸化使稚参新陈代谢的能量大部分用于维持渗透压平衡，用于维持生长的能量减少，从而造成稚参生长发育迟缓(Yuanetal.,2016)。此外，酸化环境使参与代谢的的酶活性下降，影响代谢率，同时，海水酸化使稚参骨片的主要成分———文石和方解石饱和度降低，稚参体内血碳酸含量增加，抑制了稚参的钙化能力。温度升高则增加了稚参体内酶的活性，使代谢速率增加，从而促进了稚参生长发育。虽然升温可以缓解由于酸化引起的生长能降低和代谢反应受抑制的负面影响，但是钙化率降低和CaCO3饱和度降低却无法被抵消。对海胆的相关研究表明，在海水酸化和升温共同作用下的海胆骨针发育状况与单一酸化胁迫的发育状况无显著差异(Wolfeetal.,2013)。稚参的管足尚未发育，仅靠口触手完成摄食和运动，钙化速率减慢将会影响口触手内C形骨片发育，导致稚参摄食量不足进而延迟稚参发育(邱天龙，2013)，这一影响同样无法被升温抵消。

除上述影响外，稚参个体间差异也受升温和酸化的影响逐渐增加。在养殖空间分配不合理、附着环境不适宜和饲料配比不均衡(Qiuetal,2014a,2014b)等环境不利的情况下，高密度养殖的稚参会出现部分个体生长迟缓或停止生长的的现象，俗称“老头苗”(邱天龙，2013)。并且这一现象随个体差异增加而加剧(Qiuetal.,2014a)。本研究中，海水酸化和升温的单因素和综合作用下稚参的生长均出现“老头苗”的现象，究其原因是否与养殖环境不适宜和养殖方式不合理有关，尚有待进一步研究。但就稚参发育而言，海水酸化和升温增加了稚参个体间发育差异，较大的个体发育迅速，较小的个体停止发育甚至死亡，最终造成稚参存活率降低。

海洋生物对变化的环境具有一定的耐受性和适应性(Melzneretal.,2009)。Dupont等(2013)的研究表明，长时间暴露于酸化海水中的海胆通过调节自身能量收支平衡以抵御酸化环境造成的负面影响。在本研究中，实验进行到中期，酸化升温组和对照组的稚参特定生长速率差异逐渐缩小，表明稚参具有较强的耐受性来应对气候变化。而升温在稚参的适应过程中起到一定的调节作用。目前在对海胆的研究中同样提出，适度的变暖和充足的食物可减缓酸化产生的负面影响，并且其可塑性研究表明海胆有能力适应不断变化的气候(Byrneetal.,2020)。

稚参体色变化结果同样表明，升温对酸化产生的消极影响有减缓作用。在整个发育过程中，对照组和酸化升温组稚参体色发育阶段几乎一致，各阶段发育周期也没有显著差异。升温组各阶段发育周期虽然最短，但是同一发育时间稚参体色差异较大。当升温组80%以上稚参体色完全变黑时，仍有少数稚参刚完成棘刺色素沉着，处于体色早期变化阶段。其余实验组未出现这一现象。这一结果与稚参体重变异系数结果相似。已有研究发现，个体越小的稚参色素覆盖面积增加的比例越小，即体色变化完成的越慢(Zamoraetal.,2017)，因此温度升高也会使稚参个体间体色差异逐渐增大。就酸化组稚参而言，体色变化作为一项生理过程同样受代谢速率和能量收支的影响，酸化使代谢减慢进而使体色合成速率降低，而维持生长的能量减少，用于体色合成的能量也会相对减少。到实验结束时酸化组仅有少部分稚参刚刚完成体壁颜色的初步覆盖。升温则通过提高代谢速率和摄食能促进了稚参体色变化，使两者共同作用下的稚参体色变化情况与对照组一致。目前对稚参体色变化的研究较少，未来的研究应在深度了解稚参体色变化机制的基础上探究气候变化对其影响的内在原因。

总之，我们的研究结果表明，海水变暖能够弥补酸化对刺参稚参产生的负面影响。但本研究中只关注了其稚参发育的体色变化阶段，而其他发育和生长阶段的研究尚缺乏，尤其是从受精卵到稚参的早期发育阶段。另外，鉴于刺参在生态系统和分类地位上的重要性，需要进一步从分子层面揭示刺参对海洋酸化和升温的响应机理。

宋铭山,杨晓龙,张安国,刘永健,杨大佐,赵欢,袁秀堂.海水酸化及升温对刺参稚参生长和变色的影响[J].生态学杂志,2020,39(05):1609-1616.

基金：国家自然科学基金资助项目(41676164);国家自然科学基金青年科学基金项目(41906115);国家海洋环境监测中心博士科研启动经费项目(海洋酸化下刺参对近岸生态系统碳酸盐平衡的调控机制)资助.