Dixon等在2012年发现了一种新的细胞死亡形式，主要由铁积累产生大量的脂质活性氧(Reactive oxygen species, ROS)而导致细胞死亡，将其命名为铁死亡[1]。ROS和抗氧化系统通过复杂的特殊机制控制氧化应激，维持细胞的动态平衡，这种情况在中枢神经系统(Central nervous system, CNS)中也存在。在这些控制氧化应激的因素中，胱氨酸/谷氨酸逆向转运系统xc-维持谷胱甘肽(Glutathione, GSH)的合成和ROS的清除。抑制系统xc-会导致细胞内GSH水平迅速下降，脂质源性ROS积累，进而诱导细胞死亡[2]。脂质和蛋白质氧化所导致炎症反应和DNA改变，是神经元过早衰老、功能丧失和死亡的触发因素，而铁代谢失控相关的自由基会引起细胞内氧化应激增加，从而导致神经系统损伤。铁死亡已被证明与神经系统损伤有关，本文讨论铁死亡的主要引发途径以及饲料中常见重金属元素所引起的神经毒性与铁死亡之间的联系。

1、铁死亡及其发生机制

通过显微镜观察发现，铁死亡的细胞中线粒体会出现萎缩，受铁死亡程度影响，线粒体中的嵴减少或消失，线粒体膜密度增加甚至破裂，这种独特的细胞形态变化可作为铁死亡的诊断标志。不同于细胞凋亡、自噬和坏死，铁死亡不会使细胞膜发生改变，且细胞核大小也正常，无染色质浓度变化。铁死亡细胞内部会出现大量的铁蓄积，过量的铁经芬顿反应产生大量ROS,而参与抗氧化系统的GSH和谷胱甘肽过氧化酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)耗竭导致过量的ROS在细胞内堆积[3]。Fe2+可以通过形成有毒的脂质自由基，与膜磷脂中的多不饱和脂肪酸结合，使其过氧化，最终导致细胞死亡[4]。事实上，脂质过氧化物(Lipid peroxidation, LPO),主要是磷脂酰乙醇胺-OOH(Phosphatidyl ethanolamine-OOH,PE-OOH)水平的增加会导致铁死亡，而铁似乎充当了催化剂或调节剂[5]。因此，这种形式的细胞死亡可以被甲磺酸去铁胺铁螯合剂(Deferoxamine mesylate, DFOM)和抗氧化剂维生素E抑制[6]。研究发现，肿瘤抑制基因p53也可从多方面调控铁死亡[7]。

1.1铁代谢

铁是人体内必不可少的微量元素，也是重要的氧化还原金属，在脂质过氧化过程中对自由基的形成和传递起着重要作用[8]。正常的生理活动会受到铁在体内的含量和分布的影响。肠道吸收的Fe2+或红细胞降解形成的Fe2+可被铜蓝蛋白氧化成Fe3+,Fe3+进入细胞需要载体，其先与转铁蛋白(Transferrin, Tf)结合形成Tf-Fe3+,再与膜蛋白上的Tf受体1(Transferrin receptor protein 1,TFR1)形成复合物后才可进入细胞[9]。抑制编码TFR1的基因TFRC可减轻由铁死亡激活剂Erastin诱导的细胞铁死亡，若对细胞进行补铁则会抵消这种保护作用[10]。研究发现，热休克蛋白β-1(Heat shock protein beta-1,HSPB1)可以通过抑制TRF1的表达进一步降低细胞内的铁浓度，因此从抑制TRF1的角度出发，可通过过表达HSPB1来降低细胞内的铁浓度，从而抑制铁死亡[11]。此外，还可通过促进铁蛋白的合成来减少细胞内铁的含量。铁蛋白轻链(Ferritin light chain, FTL)和铁蛋白重链1(Ferritin heavy chain 1,FTH1)是铁蛋白的主要组成元件。研究表明，抑制铁反应元件结合蛋白2(Iron responsive element binding protein 2,IREB2)(一种铁代谢的主要转录因子)的表达，可使FTL和FTH1过表达，最终有效抑制Erastin引起的铁死亡[12]。铁蛋白自噬需要核受体辅活化子4(Nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)的辅助作用，自噬降解出的铁导致细胞内铁含量增加，最终引起铁死亡[13]。

1.2谷胱甘肽过氧化酶4

现有关铁死亡研究最多的是GPX4,在铁死亡过程中，GPX4以还原型GSH为底物，将有毒的磷脂过氧化物(Phospholipid-OOH,PL-OOH)还原为无毒的磷脂醇(Phospholipid-OH,PL-OH)[14]。GPX4清除LPO的关键在于通过胱氨酸/谷氨酸逆向转运系统xc-合成的GSH。非必需氨基酸半胱氨酸是GSH合成的限速化合物。半胱氨酸可以通过胱氨酸氧化反应生成，胱氨酸主要通过系统xc-从细胞外空间输入，少量可以直接进入细胞[15]。现已有化合物或药物可以通过影响溶质转运第7家族的第11个成员(Solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)的功能来抑制铁死亡，也许可以成为治疗神经系统损伤的新靶点。有研究发现，Erastin和索拉芬妮可抑制系统xc-,使细胞对GSH的合成原料胱氨酸的摄入大幅减少，导致所合成的GSH无法满足消耗，最终耗竭引发铁死亡[16]。GPX4抑制剂RSL3(RAS-selective lethal 3)这种铁死亡诱导剂则直接作用于GPX4,通过降低GPX4活性导致细胞内的LPO无法得到清除，最终使细胞发生铁死亡[17]。因此开发增强GPX4表达的药物在临床治疗铁死亡上具有重要意义。

GSH的合成还受核因子红细胞系2相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)通路的调控，Nrf2在细胞抗氧化系统中起重要作用。在氧化应激条件下，Nrf2从Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)中解离出来，导致Nrf2积累，并启动其下游对抗氧化应激的靶基因转录[18]。Nrf2可以通过多种途径来调控GSH的合成，例如，调节谷氨酸半胱氨酸连接酶(Glutamate cysteine ligase, GCL)、谷胱甘肽合成酶(Glutathione synthetase, GSS)、谷胱甘肽S转移酶(Glutathione S-transferase, GST)和谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase, GR)的催化，以及调节系统xc-的轻链亚基。Nrf2还与氧化酶还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)[例如NAD(P)H∶醌氧化还原酶1[NAD(P)H∶quinone oxidoreductase 1,NQO1]和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 2,NOX2)]的调节有关[19]。因此，Nrf2可有效抑制铁死亡，在细胞抵抗铁死亡中具有重要意义。

1.3脂质代谢

多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids, PUFAs)是人体必需的脂肪酸，可以增加细胞膜的流动性，降低血液中的胆固醇含量，但细胞内过量的Fe2+会使细胞膜中PUFAs发生脂质过氧化。溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3(Lysophosphatidylcholine acyltransferase 3,LPCAT3)、酰基钴合成酶长链家族成员4(Acyl-coa synthetase long chain family member 4,ACSL4)和NADPH在Fe2+的影响下，可与PUFAs发生酶联反应[20]。PUFAs氧化过程可在有酶或者无酶的作用下发生，无酶氧化过程是非选择性和非特异性的，产生的ROS和羟基自由基主要源于芬顿反应，因此，氧化速率与PUFAs分子中双烯丙基氢的数量成正比，主要以6、5、4、3和2个双键多不饱和脂肪酸的磷脂(PUFA-containing phospholipids, PUFA-PLs)为主，最终导致高度多样化的氧化产物积累；PUFAs的酶促氧化过程主要是通过脂氧合酶(Lipoxygenases, LOXs)来完成[21]。LOXs是催化区域含铁的二氧酶，能促进含有至少2个孤立顺式双键的PUFAs氧化。LPCAT3和ACSL4是磷脂乙醇胺(Phosphatidyl ethanolamines, PEs)生物合成和重构的关键酶，可使不饱和脂肪酸酯化形成PEs。当ACSL4和LPCAT3高表达时，PEs生物合成增加，经LOXs氧化后形成LPO[21]。

过量的LPO会破坏细胞膜，导致线粒体发生萎缩和损伤等形态学改变。此外，LPO分解形成的活性衍生物，例如4-羟壬二酸酯(4-Hydroxynonenal, 4-HNE)和丙二醛(Malondialdehyde, MDA),可与核酸和蛋白质发生反应，破坏膜的完整性，导致细胞破裂[20]。研究表明，外源性单不饱和脂肪酸可使细胞对铁死亡产生一定的抵抗力，并减少LPO和可氧化性PUFAs的积累[22]。

1.4 p53介导的铁死亡

越来越多的证据表明，p53在调节铁死亡中起着至关重要的作用，在一些癌细胞中，p53激活可严重抑制SLC7A11的表达，导致细胞内半胱氨酸耗竭，并使细胞对铁死亡敏感[23]。已有研究表明，在p53基因沉默后，用ROS处理人肺癌细胞(H1299细胞),细胞活性保持不变；然而，在p53激活后用ROS处理时，90%的细胞死亡，表明p53的激活降低了细胞的抗氧化能力；用铁死亡抑制剂fer-1处理后，细胞死亡率显著下降，也表明p53在铁死亡中发挥重要作用[3]。亚精胺/精胺N1乙酰转移酶1(Spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1,SAT1)是p53的直接靶标，可催化亚精胺和精胺的乙酰化，是多胺分解代谢的关键酶，可以被一种小分子E3泛素-蛋白连接酶MDM2(Mouse double minute 2 homolog)抑制剂以p53依赖性方式激活，以促进ROS依赖性脂质过氧化物形成，使细胞对铁死亡敏感[24]。有研究报道，在SAT1过表达细胞中，ROS诱导的细胞死亡只能被铁蛋白酶-1抑制，但SAT1不影响SLC7A11和GPX4的表达[25]。也有研究表明，花生四烯酸12-脂氧合酶(Arachidonate 12-lipoxygenase, ALOX12)是脂氧合酶家族中介导铁死亡的p53的另一个重要正调节因子，ALOX12失活可抑制ROS应激诱导的p53介导的铁死亡，与GPX4和ACSL4的激活无关[26]。这些研究表明，p53可从不同靶点多方面调控铁死亡。

2、铁死亡与重金属诱导的神经毒性

锌、铁和镍等都是人体和动物生长发育过程中维持机体生态平衡不可或缺的金属微量元素，同时也是有毒的环境污染物和工业污染物，它们能够透过血脑屏障进入脑并在脑内蓄积，急性和慢性暴露均会导致神经系统的功能障碍，引起脑和神经系统疾病。目前，有关重金属神经毒性的报道很多，但是关于它们毒性作用的分子机制研究较少，有研究表明，重金属神经毒性机制与铁死亡有关联[27]。

2.1锌诱导神经毒性

锌是一种必需的矿物质元素，在人体和动物的许多生理功能中起重要作用。以氧化锌纳米颗粒(Zinc oxide nanoparticles, ZnO NPs)为例，有研究显示，ZnO NPs作为食品强化补充剂，可以改善人体和动物生长，更好地促进免疫器官的发育，提高对某些疾病或病症的免疫力。目前，ZnO NPs在全球日常中的应用一直稳步上升，纳米级颗粒可以通过吸入、摄入和注射等各种暴露途径进入人体，可能会造成神经毒性、细胞毒性和遗传毒性等严重后果，因此展开了对ZnO NPs毒性及其机制的研究[28]。

ZnO NPs诱导神经元铁死亡已得到证实，在小鼠气管内滴注ZnO NPs会引发小鼠大脑皮层神经元铁死亡，线粒体嵴显著减少或消失，伴随严重的液泡病变，线粒体膜通透性增加，细胞内ATP含量急剧降低，而组织内的铁水平显著提高，脂质过氧化产物积累，GPX4和SCL7A11蛋白表达水平显著降低，相反，电压依赖性阴离子通道蛋白3(Voltage dependent anion channel 3,VDAC3)的蛋白表达水平呈上升趋势[27]。ZnO NPs处理大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC-12细胞可导致细胞发生铁死亡，ZnO NPs以剂量依赖性方式显著降低GPX4和SCL7A11的蛋白表达水平，这2种蛋白表达减少可以通过铁螯合剂去铁胺(Deferoxamine, DFO)或铁死亡抑制剂Fer-1来改善，ZnO NPs可选择性激活c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)途径，促使PC-12细胞发生铁死亡，抑制铁死亡可以缓解ZnO NPs诱导的体内和体外神经元死亡[29]。深入研究ZnO NPs神经毒性与铁死亡之间的关系，可为临床治疗ZnO NPs气道暴露引起的神经毒性提供参考依据。

2.2镉诱导神经毒性

镉(Cd)是一种对人体健康有害的有毒且致癌重金属，主要由工业活动产生，例如，垃圾填埋场渗滤液、化石燃料燃烧、采矿残留物和农药的使用。Cd暴露与神经系统疾病和损伤有明显的联系。阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)等神经退行性疾病与神经元的损伤和丧失，以及大脑功能受损有关。有研究表明，大鼠体内Cd暴露可导致血脑屏障形态发生变化[30]。也有研究指出，小鼠大脑中Cd水平升高可能会影响机体抗氧化能力，出现明显的神经退行性行为，甚至发生AD[31]。有研究表明，Cd暴露可通过铁死亡途径导致猪的大脑和小脑损伤。猪只每日饲喂含20 mg/kg氯化镉的谷物，40 d后处死，收集大脑和小脑组织，结果显示，Cd暴露组猪只的大脑和小脑均发生损伤，抗氧化能力明显下降，氧化应激增加，大脑中坏死基因含量减少，铁死亡途径基因丰度增加，而小脑中结果相反，铁调素抗菌肽(Hepcidin antimicrobial peptide, HAMP)基因是铁死亡的调节剂，在Cd暴露期间显著增加，抑制铁转运蛋白1(Ferroportin 1,FPN1)转运铁离子，进一步阻止Cd扩散，维持铁稳态，抑制脑铁死亡的激活，这可能是Cd暴露组猪小脑铁死亡受到抑制，大脑铁死亡被促进和激活的原因[32]。铁死亡在越来越多由金属元素引起的神经系统损伤和疾病中被报道，表明其在中枢神经系统变性中具有重要作用。

2.3铁诱导神经毒性

铁是人体和动物必需的微量元素，本身不具有毒性，但摄入过量的铁制剂时也可能导致铁中毒。大量口服Fe2+化合物除对胃肠黏膜造成刺激外，还可对中枢神经系统产生毒性作用，甚至因呼吸麻痹和抽搐而导致死亡。

研究表明，小鼠高铁饮食3个月后，可出现明显的AD表征，并且大脑中SLC7A11和GPX4等对抗铁死亡的氧化防御系统表达水平均降低，表明铁积累会使脑细胞发生铁死亡，导致ROS和自由基增加，破坏神经元和神经胶质细胞功能，甚至造成神经元丢失[33]。研究表明，铁诱导的多巴胺能变性是帕金森病(Parkinson's disease, PD)发病机制中的一个重要因素[34]。在患PD大鼠和猴子的黑质致密部发现了铁代谢失衡，出现了铁积累的现象[35]。铁积累引发细胞铁死亡可能是导致PD患者黑质多巴胺能神经元氧化损伤的原因，例如，PD患者体内出现的羟基自由基升高和脂质过氧化，都是铁死亡的标志变量，使用去铁胺(Deferoxamine, DFO)可以抑制PD患者体内的铁死亡，对神经元损伤起到保护作用[36]。研究表明，使用DFO对PD模型小鼠进行治疗，可防止黑质多巴胺能神经元的丢失，缓解运动缺陷等症状[37]。亨廷顿病(Huntington's disease, HD)早期患者的基底节中铁含量显著升高，通过磁共振成像(Magnetic resonance imaging, MRI)和定量易感地形图可观察到HD患者的枕叶皮质、苍白球和壳核中出现大量铁积累，表明铁的失调及其在脑细胞和亚细胞部位的蓄积可能与HD的发病机制有关[38]。HD患者神经元的亚细胞器中出现铁积累，引起氧化损伤导致细胞发生铁死亡，加速退行性发展。通过渗透泵向小鼠左心室输入DFO或口服去铁酮(Deferiprone, DFP)均可在一定程度上缓解R6/2小鼠模型的HD症状，但是DFO在人类HD患者中也许不会有在小鼠模型中的作用，因为它无法穿透血脑屏障，还可能引起全身性缺铁[39]。目前，对AD、PD和HD等神经疾病患者进行铁死亡检测，均出现显著的铁死亡特征。虽然尚不清楚是由铁死亡导致这类疾病的发生还是由这类疾病引起的铁死亡，且具体机制还有待深入研究，但是了解铁死亡的发生机制和抑制机制，可为此类疾病的预防和治疗提供新方向。

2.4镍诱导神经毒性

镍是一种坚硬的、有延展性的、银白色的过渡金属，是一种丰富的天然元素，是人体和动物所必需的生命元素，但其含量极其微少。镍还可以与其他元素(如氯、硫和氧)结合，形成可明显溶于水的镍化合物。镍是现代冶金的重要参与者，被用于各种冶金工艺，例如，合金生产、电镀、镍镉电池的生产以及化学和食品工业的催化剂[40]。据报道，镍是对人类健康构成严重威胁的金属元素之一。

有研究表明，镍的神经毒性取决于暴露途径，可能具有许多作用机制，包括微量元素(如铁和钙)稳态破坏、酶活性受损、神经递质破坏、能量代谢紊乱、氧化应激和线粒体氧化应激诱导[41]。目前，鲜有相关研究直接表明镍的神经毒性由铁死亡介导，但是镍能影响铁稳态，引起氧化应激，并导致LPO生成。氯化镍(NiCl2)处理雄性Wistar大鼠后，GSH合成减少，GST、GR和LPO生成增多，同时伴随谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPx)活性降低[42]。暴露于镍的大鼠，大脑中的氧化损伤显著诱导了LPO的生成，GSH水平的降低，以及超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)和过氧化氢酶(Catalase, CAT)活性的降低[43]。镍作为过渡金属，也有可能扰乱铁稳态，而铁稳态一旦被扰动，很可能诱导ROS形成，尤其是线粒体中代谢酶的失活[41]。这些研究表明，镍神经毒性可能与铁死亡存在潜在联系。镍神经毒性与铁死亡之间的联系需要进一步的研究来确定。镍暴露会对记忆、学习、运动、情感和认知过程造成损害，研究镍神经毒性与铁死亡之间的关系，可能会有效减轻在神经元损伤过程中被忽视的重金属所造成的不利影响。

3、小结与展望

自铁死亡被发现以来，研究方向主要集中于肿瘤的预防和治疗。随着研究的不断深入，铁死亡在神经损伤和退行性疾病中的作用愈发关键。例如，对AD、PD和HD等患者进行铁死亡检测，均出现显著的铁死亡特征。而部分重金属又能通过饲料进入动物体内并蓄积，影响铁稳态，诱导细胞铁死亡。本文讨论了饲料中常见的重金属元素引起的神经损伤与铁死亡之间的联系，其具体机制还有待深入研究。了解铁死亡与重金属元素神经毒性之间的关系，找到合适的保护剂或者抑制剂，可为该类神经损伤的预防和治疗提供新方向。

基金资助:国家自然科学基金(32302926);中国博士后科学基金(2021M700708);农业农村部智慧养殖重点实验室(部省共建)开放基金(2023-TJAUKLSBF-2107);

文章来源:沈垚,张宇航,曹凯,等.重金属诱导的铁死亡与神经毒性关系的研究进展[J].中国兽医杂志,2024,60(05):107-112.