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咀嚼型洁齿骨活性成分体外抑菌试验和临床应用效果评估

2024-05-17 178 上传者：管理员

摘要：为了评估咀嚼型洁齿骨对成年犬口腔健康状况的改善情况及其主要活性成分的体外抑菌效果，本试验采用牛津杯法定性检测咀嚼型洁齿骨中主要活性成分对变异链球菌、粘性放线菌、嗜酸乳杆菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌具核亚种的抑菌活性；并选取30只临床健康成年犬，经超声波洁牙后，随机分为3个组，对照组正常饲喂，试验1组和试验2组分别添加不同品牌的洁齿骨，每间隔30 d由同一名兽医对试验犬的牙菌斑、牙结石和牙龈炎进行医学评分并测定犬口气值。结果显示：咀嚼型洁齿骨中活性成分茶多酚、厚朴酚、杜仲提取物、金银花提取物、溶菌酶和保鲜复合酶对5种口腔常见致病菌的生长抑制效果相对较好；洁牙后90 d,试验1组和试验2组犬牙菌斑和牙结石评分均显著低于对照组(P<0.05);洁牙后30和90 d,试验2组犬牙龈炎评分显著低于对照组(P<0.05);与对照组相比，洁牙后饲喂咀嚼型洁齿骨明显改善了犬口臭情况，试验2组犬口气测定值均低于试验1组，差异不显著(P>0.05)。结果表明，咀嚼型洁齿骨一定程度上可以缓解犬口腔健康状况，且添加活性成分的洁齿骨效果相对较好。

关键词：
口腔健康
口臭
咀嚼型洁齿骨
抑菌活性
牙龈炎
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研究显示，75%～85%的3周龄以上的犬患有牙周病(Periodontal disease, PD),且大部分都未得到合适的治疗[1,2],PD的特点是牙龈炎和牙周炎，前者是牙龈炎症，后者是牙周韧带和牙槽骨的炎症，这些情况的发生与牙菌斑沉积密切相关，牙菌斑中含有大量口腔致病菌，在引起免疫反应的同时还会对口腔组织造成损害[3]。口腔微生物会引起机体免疫和炎症反应，且PD通常被认为是口腔微生物菌群失衡所导致的[4]。此外，口臭常与PD相关，口腔中的微生物代谢蛋白质产生的挥发性硫化物会引起口臭[5]。新型牙齿咀嚼物主要通过清除食物残渣和减少口腔中有害微生物来改善口腔健康状况，从而预防犬PD的发生[6]。随着新型咀嚼型洁齿骨进入市场，有试验证明其对预防犬PD起到关键的作用[7]。大量抑菌试验表明，番石榴提取物[8]、茶多酚[9,10]、杜仲提取物[11]、金银花提取物[12,13]、厚朴酚[14]和溶菌酶[15]等活性成分均具有较明显的抗菌消炎作用。变异链球菌、粘性放线菌、嗜酸乳杆菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌等是口腔常见的几种致病菌[16,17],因此，本试验选用商品思味特洁齿骨中添加的9种主要活性成分，对变异链球菌、粘性放线菌、嗜酸乳杆菌、具核梭杆菌具核亚种和牙龈卟啉单胞菌进行体外抑菌试验，并将洁齿骨对试验犬的牙菌斑、牙结石、牙龈炎和口臭的改善情况进行比较，以期为新型咀嚼型洁齿骨在兽医临床上的应用提供理论依据。

1、材料与方法

1.1试验菌种

变异链球菌、粘性放线菌、嗜酸乳杆菌、具核梭杆菌具核亚种和牙龈卟啉单胞菌，均购自北京北纳创联生物技术研究院。

1.2主要试剂

MRS肉汤(嗜酸乳杆菌)、MRS琼脂(嗜酸乳杆菌)、脑心浸液肉汤(变异链球菌)、脑心浸液琼脂(变异链球菌)、硫乙醇酸盐液体培养基(具核梭杆菌具核亚种)、胰蛋白胨大豆培养基(粘性放线菌)、哥伦比亚CNA血琼脂平板(牙龈卟啉单胞菌),均购自青岛海博生物技术有限公司；胰蛋白胨大豆肉汤(粘性放线菌),购自上海江莱生物科技有限公司；杜仲提取物、金银花提取物、丝兰提取物、番石榴提取物、厚朴酚、茶多酚、溶菌酶、保鲜复合酶和七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O),由重庆思味特宠物用品有限公司提供。

1.3主要仪器

UV-1800紫外分光光度计，上海翱艺仪器有限公司产品；A8-超声波洁牙机，上海微润医疗器械有限公司产品；口气分析仪，深圳艾比诺电子有限公司产品。

1.4试验方法

1.4.1菌种活化

按使用说明配置培养基并活化传代菌种，菌种传代培养2次后制备菌悬液，调整菌悬液浓度为107 CFU/mL,用于抑菌活性的测定。取配置好的菌悬液200μL均匀涂布于培养基上，再用无菌镊将牛津杯轻放在培养基表面，轻压使其贴合，加入200μL待测活性提取物后，37℃恒温培养，采用游标卡尺测量有效抑菌圈直径，每个样品设置3个重复，另外设置阴性对照(无菌蒸馏水)和阳性对照(75%酒精)。判定标准[17]:抑菌圈直径≥20 mm为高度敏感，抑菌圈直径在10～19 mm为中度敏感，抑菌圈直径<10 mm为不敏感，无抑菌圈为耐药。

1.4.2洁齿骨临床应用效果评估

选取30只健康成年犬，经超声波洁牙后，随机分为3个组，分别为对照组、试验1组和试验2组，每组10只，对照组正常饲喂，试验1组添加普通洁齿骨，未添加任何活性成分，仅有咀嚼摩擦作用；试验2组添加重庆思味特宠物用品股份有限公司提供的新型咀嚼型洁齿骨，添加了番石榴提取物、茶多酚、杜仲提取物、金银花提取物、厚朴酚、溶菌酶等多种活性成分，整个试验周期内，所有犬均食用同一商品粮。试验分别于洁牙前、洁牙后30、60和90 d将试验犬进行镇静，由同一名兽医对牙菌斑、牙结石和牙龈炎进行医学评分，并使用口气分析仪测定犬口气值。

评分标准：参照Cecilia等[18]的方法，并根据牙菌斑、牙结石和牙龈炎严重程度进行评分，其中0分为正常状况，1分为轻度临床症状，2分为中度临床症状，3分为重度临床症状。

1.5统计分析

试验结果以“平均值±标准误(Mean±SE)”方式表示。采用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析，使用最小显著性差异(Least significant difference, LSD)法进行显著性检验，并进行多重比较，以P<0.05表示差异显著。

2、结果

2.1咀嚼型洁齿骨中活性成分对5种口腔致病菌的抑菌活性

番石榴提取物仅对嗜酸乳杆菌生长存在抑制作用；茶多酚、杜仲提取物、厚朴酚、溶菌酶和保鲜复合酶对5种口腔致病菌生长存在中度或高度抑制作用；而丝兰提取物和ZnSO4·7H2O仅对具核梭杆菌具核亚种生长不存在抑制作用；阳性对照可明显抑制除变异链球菌外的其余4种口腔致病菌的生长(表1)。表明茶多酚、杜仲提取物、金银花提取物、厚朴酚、溶菌酶和保鲜复合酶对5种口腔致病菌生长的抑制效果相对较好。

表1咀嚼型洁齿骨中活性成分对5种口腔致病菌的抑菌活性

2.2咀嚼型洁齿骨对成年犬牙菌斑评分的影响

洁牙前，各组试验犬牙菌斑评分无显著差异(P>0.05);洁牙后30 d,试验1组牙菌斑评分显著高于对照组和试验2组(P<0.05),但试验2组牙菌斑评分显著低于对照组(P<0.05);洁牙后60和90 d,试验1组和试验2组牙菌斑评分均显著低于对照组(P<0.05),且试验1组牙菌斑评分显著低于试验2组(P<0.05)(图1)。

2.3咀嚼型洁齿骨对成年犬牙结石评分的影响

洁牙前，各组试验犬牙结石评分差异不显著(P>0.05);洁牙后30 d,试验2组犬牙结石评分显著低于对照组和试验1组(P<0.05),对照组和试验1组差异不显著(P>0.05);洁牙后60 d,试验1组牙结石评分显著低于对照组(P<0.05),与试验2组差异不显著(P>0.05),且试验2组与对照组差异不显著(P>0.05);洁牙后90 d,试验1组和试验2组显著低于对照组(P<0.05),且试验1组显著低于试验2组(P<0.05)(图2)。

图1咀嚼型洁齿骨对成年犬牙菌斑评分的影响

同一检测时间不同小写字母表示组间差异显著，P<0.05;相同小写字母表示组间差异不显著，P>0.05;

图2咀嚼型洁齿骨对成年犬牙结石评分的影响

2.4咀嚼型洁齿骨对成年犬牙龈炎评分的影响

洁牙前，各组试验犬牙龈炎评分差异不显著(P>0.05);洁牙后30 d,对照组和试验1组牙龈炎评分显著高于试验2组(P<0.05),对照组和试验1组差异不显著(P>0.05);洁牙后60 d,试验1组牙龈炎评分显著高于试验2组(P<0.05),试验2组牙龈炎评分低于对照组，但差异不显著(P>0.05);洁牙后90 d,试验2组牙龈炎评分显著低于对照组(P<0.05),与试验1组无显著差异(P>0.05)。洁牙后，与对照组和试验1组相比，试验2组牙龈炎评分均呈相对较低的水平(图3)。

图3咀嚼型洁齿骨对成年犬牙龈炎评分的影响

2.5咀嚼型洁齿骨对成年犬口臭的影响

洁牙前，各组试验犬口气值无显著差异(P>0.05);洁牙后30 d,试验1和试验2组犬口气值显著低于对照组(P<0.05),试验1组和试验2组差异不显著(P>0.05);洁牙后60和90 d,试验2组犬口气值低于试验1组，差异不显著(P>0.05),试验2组犬口气值显著低于对照组(P<0.05);洁牙后60 d,试验1组犬口气值低于对照组，但无显著差异(P>0.05),洁牙后90 d,试验1组犬口气值显著低于对照组(P<0.05)(图4)。

图4咀嚼型洁齿骨对成年犬口气值的影响

3、讨论

咀嚼型洁齿骨，表面的细孔和其特殊的结构可以添加多种活性成分，能够在机械清洁牙齿的同时缓慢释放进入口腔，达到抑制细菌滋生和缓解口臭的效果[18,19]。本试验发现，茶多酚、杜仲提取物、厚朴酚、金银花提取物、溶菌酶和保鲜复合酶对试验选取的5种口腔常见致病菌起到较为明显的抑制作用。杨暤[20]研究发现，茶多酚不仅对牙周主要致病菌有着较强的抗菌活性，还具有抗变态反应、清除自由基和促进牙周组织重建的作用。研究表明，绿原酸能够有效地抑制变异链球菌和牙龈卟啉单胞菌等口腔致病菌的活性[21,22]。本试验发现，金银花提取物和杜仲提取物对除嗜酸乳杆菌外的4种口腔致病菌均存在较为明显的抑制作用。Ho等[23]研究发现，厚朴酚可以抑制牙龈卟啉单胞菌和放线杆菌等致病菌的生长和繁殖活性，有效预防牙周疾病。此外，厚朴酚可以穿透生物膜杀灭变异链球菌，并且不会损伤牙龈上皮细胞，是一种较为理想的口腔抑菌活性物质[24]。溶菌酶具有抗菌、抗病毒、消炎和增强免疫力等特性，其对口腔变异链球菌、白色念珠菌和牙龈卟啉单胞菌均存在一定程度的抗菌活性[25]。保鲜复合酶作为一种复合酶制剂，既具有防腐保鲜的作用，又对口腔致病菌存在较为明显的抑制效果。

本试验测试了2种咀嚼型洁齿骨对犬牙菌斑、牙结石、牙龈炎和口臭的改善情况，结果显示，试验1组和试验2组犬牙菌斑评分和牙结石评分明显降低，洁牙后30 d,试验2组犬牙龈炎评分显著低于对照组和试验1组，可能是由于新型咀嚼型洁齿骨中的活性成分抑制了口腔致病菌的繁殖，降低了牙菌斑和牙结石的沉积速度，间接促进了犬牙龈炎的恢复。对洁牙后犬口气值测定结果显示，整个试验阶段内，试验2组犬口气值明显低于对照组，且洁牙后60和90 d时，犬口气值在一定程度上低于试验1组。硫化氢和甲硫醇是引起口源性口臭的主要原因，口腔中多种细菌与口臭密切相关，具核梭杆菌具核亚种和牙龈卟啉单胞菌等牙周病原菌在体外试验中表现出较活跃的产硫能力，可诱导产生挥发性硫化物导致口臭[26]。锌离子在抑制牙菌斑中细菌生长的同时，还能够通过与硫化氢发生化学反应来减少口腔异味[27]。整体而言，咀嚼型洁齿骨对于减少牙菌斑和牙结石沉积以及预防牙龈炎和减少口臭都具有积极的作用，可能在未来作为一种新型保健产品来保证犬口腔健康。

参考文献:

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基金资助:重庆市技术创新与应用发展专项(cstc2019jscx-msxmX0396);

文章来源:卢玲,尹一茹,李向宝,等.咀嚼型洁齿骨活性成分体外抑菌试验和临床应用效果评估[J].中国兽医杂志,2024,60(05):136-140.

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