性别鉴定对研究鸟类(Aves)种群动态、群落结构、栖息地的利用以及行为都具有重要作用[1]。全世界现存约11000种鸟类[2]，其中约50%是单态型[3]，雌雄间形态上难以区分。已有多种方法用于单态型鸟类的性别鉴定，如形态测量、鸣声分析、解剖、泄殖腔检测和腹腔镜检测、细胞生物学与分子生物学方法鉴定等[4]。上述方法中，细胞生物学与分子生物学难以在野外快速鉴定鸟类性别，鸣声分析在非繁殖期难以使用，解剖、泄殖腔检测和腹腔镜检测等方法操作烦琐或对会鸟体造成伤害[4]。

利用形态测量进行性别鉴定是鸟类研究的重要工作，国内外利用形态参数鉴定性别的研究较为常见。鸟类的雌雄形态可能具有二态性，如红尾鵟(Buteojamaicensis)雌雄间在体重、嘴峰长、尾长上存在显著差异[5];雄性灰伯劳(Laniusexcubitor)的翅长、尾长均显著大于雌性[6];发冠卷尾(Dicrurushottentottus)的喙粗、头喙长、跗蹠长、翅长、尾长、发羽数和第一根发羽长均存在差异，且雄性显著大于雌性[7];红脚鲣鸟(Sulasula)雌性体重大于雄性[8]。此外，羽色与饰羽斑块大小在雌雄间也可能存在二态性，雄性牛背鹭(Bubulcusibis)头部、肩部以及胸部饰羽斑块显著大于雌性[9];大嘴乌鸦(Corvusmacrorhynchos)具有彩虹光泽的羽毛，雄性比雌性更鲜艳[10]。自然选择和性选择对两性影响的不同，被认为导致了鸟类在形态上出现性二态，例如雌雄同域分布，在自然选择压力下为扩展生态位同时减小两性食物竞争，雌雄喙出现性二态;雌性对雄性尾长的选择偏好，导致雄性尾羽长于雌性[11]。研究鸟类形态是否存在性二态时，分子生物学结果是鉴定性别的重要依据，因为DNA分子技术逐渐成熟，检测结果的准确性较高[3]。鸟类性染色体上存在螺旋蛋白结合基因(CHD)，雄鸟只有CHD-Z基因，而雌鸟有两个同源拷贝即CHD-Z和CHD-W基因，因此进行PCR扩增实验时Z染色体和W染色体上的扩增产物片段大小存在差异:有1个条带的为雄性个体，有2条大小不同条带的为雌性个体[3,12,13,14]。

白头鹎(Pycnonotussinensis)隶属于雀形目(Passeriformes)，鹎科(Pycnonotidae)，鹎属，广泛分布于我国南方，包括指名亚种Py.s.sinensis、两广亚种Py.s.hainanus和台湾亚种Py.s.formosae。领雀嘴鹎(Spizixossemitorques)隶属于鹎科，雀嘴鹎属，我国分布2个亚种，指名亚种Sp.e.semitorques分布于南方各省，台湾亚种Sp.e.cinereicapillus仅分布于台湾岛[15]。白头鹎和领雀嘴鹎的指名亚种在形态上均难以区分性别，野外观察发现两种鹎是本研究地点鹎科鸟类的优势种，繁殖期雄性间都存在种内争斗[16,17]，故推测二者极可能都存在较强烈的性选择。而无论是性间选择还是性内选择都可导致雌雄个体间产生形态差异，例如雄性斗争或雌鸟偏好或许会促使体重、体长等参数在雌雄间产生性二态[18,19]。此外，亲缘关系也被证实与是否存在性二态有关，Székely等[20]研究发现同科鸟类雌雄形态差异可能相同。对鹎科鸟类的表型与基因分析发现我国分布的雀嘴鹎属具有分类独特性，而独立分支成属[21,22]。因此对这两种鹎科不同属鸟类雌雄差异性进行对比，也可为鹎科鸟种亲缘关系提供参考。

已有研究发现白头鹎指名亚种雄鸟的翅长、尾长、跗蹠长、喙峰长、喙高和体长显著大于雌鸟，两广亚种雄鸟的翅长、尾长、跗蹠长、喙峰长和喙宽显著大于雌鸟[23]。但这些指标均是测量标本，无体重、飞羽与翅膀面积等重要指标，而由于自然选择压力的不同也可导致不同种群性二态出现差异。白头鹎指名亚种的枕部白色斑块被认为可区分雌雄个体，但缺乏量化证据，已有研究仅对斑块的宽窄或大小进行数量等级划分[23,24,25]，缺乏量化分析。为鉴别白头鹎与领雀嘴鹎指名亚种雌雄形态是否存在差异，本研究以DNA分子技术为基础，通过测量形态指标，对白头鹎和领雀嘴鹎进行性别鉴定，并对比两种鹎科鸟类的性二态是否不同。

1、料与方法

1.1 个体捕捉与形态参数测量

2018年4月，于湖南长沙(112°45'E,28°1'N)在白头鹎与领雀嘴鹎活动区域架设雾网进行捕捉。测量白头鹎与领雀嘴鹎的各形态学参数，包括体重(bodymass)、跗蹠长(tarsometatarsuslength)、翅长(winglength)、飞羽长(remiges从外侧第一飞羽至第九飞羽)、尾长(taillength)、体长(bodylength)、喙峰长(beakpeaklength)、嘴裂(gapelength)、喙宽(beakwidth)、喙高(beakheight)。将白头鹎头部固定于有标尺的木板上，颈部完全贴合避免拍照角度造成影响，翅膀完全展开，用手机相机(SamsungS8,Korea)垂直拍摄(避免角度不同对结果造成影响)其枕部与翅膀，用于枕部白色斑块与翅膀面积的计算。

1.2 分子生物学鉴定

血液DNA提取:用毛细管从白头鹎与领雀嘴鹎翅下静脉采集新鲜血液，冷冻保存(-40°C)。取250μL血液样本利用试剂盒提取DNA(康为世纪，Cat:CW2087)。按照试剂盒上标注的反应体系进行PCR扩增，其组分构成为:12.5μLDNA聚合酶(PremixExTaq),2μL模板(DNA-templated)，引物(Primer)SexF与引物SexR各1μL，添加灭菌去离子水(ddH2O)至25μL。PCR反应条件为:94℃下预变性5min;95℃下变性30s,54℃下退火30s,72℃下延伸2min,35个循环;在72℃下补齐10min。用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，条件为120V,20min。电泳结果显示扩增基因长度约为190—250bp,CHD-W的扩增片段小于CHD-Z，电泳图显示1个条带的为雄性个体，2个条带的为雌性个体。反应体系的引物由Invitrogen公司合成，序列为:

1.3 面积分析

用ImageJ(v1.80)软件测量白头鹎翅膀面积与枕部白色斑块面积。首先将图片转换为8-bit，通过已经设置好的标尺(5cm)，赋值，在翅膀照片上绘制出翅膀边缘轮廓并计算面积。测量枕部白色斑块面积时首先将图片转变为8-bit，通过已经设置好的标尺(2cm)，赋值。提取白头鹎头部与枕部部分边缘(因嘴基部有白色羽毛影响结果而不提取鸟喙部分)，调整明亮程度，将其最小值设定为15，致白头鹎枕部黑白羽毛边际分明，将枕部白色斑块完全覆盖后选中，绘制出边界轮廓，测量白色斑块的面积(图1)。对存在黑色杂羽或黑色斑块的枕部羽毛，将所有白色羽毛部分面积相加作为个体的白色斑块面积。

1.4 统计分析

利用SPSS(v20.0)软件的单样本KolmogorovSmirnov检验测量参数正态性，结果均为正态分布，因此将所有形态参数进行单变量ANOVA方差分析来比较雌雄间的形态差异。对具有显著性差异的指标构建判别方程。首先观察数据分布有无特别的离异点、缺失值和不合理的分布，从而可以用该数据做接下来的判别分析。自变量为尾长、枕部白色斑块面积与翅长，类别变量为雌雄，进行Fisher判别分析，按照Wilks统计量最小的原则分析，通过会判参数得出其准确性。对比单变量与多变量准确性，得出鉴定性别的最佳参数。

2、果与分析

对捕捉到的26只白头鹎与12只领雀嘴鹎进行DNA性别鉴定，结果为白头鹎雄性16只，雌性10只;领雀嘴鹎雄性5只，雌性7只(图2)。白头鹎雄性的尾长与枕部白色斑块面积显著大于雌性(P<0.05)，翅长差异接近显著水平(P=0.081)(表1，图3—图5)。对具有显著性差异与接近显著水平差异指标进行判别分析，结果表明在单变量中枕部白色斑块面积作为白头鹎性别鉴定指标的准确性最高为70.6%;多变量指标中枕部白色斑块面积结合尾长与翅长，准确性最高为82.4%(表2)。

白头鹎的其他参数，作为身体状态与雄性竞争的指标，即体重、跗蹠长和体长在雌雄之间差异不显著(P>0.05);作为飞行能力相关参数，即飞羽与翅膀面积在雌雄之间差异不显著(P>0.05);作为与捕食相关参数，即喙峰长，嘴裂，喙宽，喙高在雌雄之间差异不显著(P>0.05)(表1)。领雀嘴鹎所有形态学数据，在雌雄间均无显著性差异(表3)。

图1白头鹎枕部白色斑块面积测量

表1白头鹎雌雄间形态参数的单因素ANOVA方差检验结果

表2判别函数对白头鹎性别判别的准确性

表3领雀嘴鹎雌雄间形态参数的单因素ANOVA方差检验结果

图2DNA性别鉴定结果

图3白头鹎尾长雌雄对比

图4白头鹎枕部白色斑块面积雌雄对比

图5白头鹎翅长雌雄对比

3、结论

本实验通过扩增鸟类性染色体的螺旋蛋白结合基因(CHD)鉴定白头鹎与领雀嘴鹎性别，扩增产物稳定，电泳结果清晰、准确，扩增成功率高。苏倡等[14]对扩增该基因鉴定雀形目鸟类性别准确性的研究中指出，根据所用引物不同，鉴定鸟类性别准确率存在差异，错误主要来自CHD-W或CHD-Z基因其中的一个扩增失败，未出现假阳性扩增的现象。因此可初步断定，本次实验所使用引物的DNA鉴别准确性高，但该引物鉴定鸟类性别准确率仍需后续检验。

研究发现白头鹎指名亚种雌雄个体在尾长和枕部斑块面积存在显著差异，翅长差异接近显著水平，上述参数均雄性大于雌性，可作为野外迅速鉴定性别的依据。领雀嘴鹎指名亚种在所有测量的形态参数上均不存在性二态。杨晓菁等[23]研究表明，白头鹎指名亚种雌雄间的尾长、翅长存在显著差异，与本文结果一致。鸟类的尾羽具有平衡身体的作用，野外观察发现，白头鹎雄性争斗时会展开尾羽平衡身体，因此尾长更长的雄性个体在争斗中可能更具有优势，进而在雌雄间产生性二态。性选择对于雌雄二态性的影响已在多物种中得到证实[10,19,26,27]，由于雌鸟对雄鸟的尾长与翅长具有选择偏好，因此尾长与翅长较大的雄性交配成功率更高，进而导致雌雄尾长与翅长产生性二态[6,28,29]。此外尾长、翅长与鸟的飞行能力呈正相关，有助于鸟类捕食与筑巢等，因此拥有更强的育雏能力[30]，繁殖期雄性白头鹎参与育雏[17]，雌性白头鹎可能偏好长尾羽的雄性。因此推测性选择可能导致白头鹎两性在形态上的差异。

白头鹎枕部白色斑块面积或许受到性选择压力。首先，我们在野外多次观察到白头鹎繁殖期鸣唱或打斗时枕部白色羽毛会展开，推测作为雄鸟的第二性征展示给其他雄鸟及雌鸟。在许多鸟类中雌性表现出对雄性饰羽的偏好[26,27,29]，因为饰羽可以从一定程度上反映身体健康状况，雌性石雀(Petroniapetronia)对雄性尾部白色羽毛斑块具有选择偏好[30];雌性牛背鹭对雄性的头部、背部和肩部饰羽都具有性选择偏好[31];在对暗眼灯草鹀(Juncohyemalis)的研究中，雄性尾羽外部白色羽毛斑块明显大于雌性，被认为受到雌鸟的选择偏好[32]。其次，本研究结果发现白头鹎雌雄个体间的枕部白色斑块面积大小主要分布范围(第一四分位数至第三四分位数)相似，即均集中在约1cm2的范围内(雌性0.952—1.933cm2，雄性1.889—2.772cm2)，但白色斑块面积的总变化范围雄性远大于雌性(雌性0.935—1.941cm2，雄性1.378—3.757cm2)。这说明在繁殖前期或繁殖期雄性的头部白色羽化倾向更明显，即集群越冬的白头鹎雄鸟之间，繁殖状态的不同步或许导致个体间白色斑块面积大小不同。或许是白头鹎以集群方式越冬，以一雄一雌方式繁殖的一种适应性策略，因为在越冬期白头鹎集大群，而领雀嘴鹎集小群[33,34]，推测在我们取样时白头鹎集群中已出现处于繁殖前期的个体，可能因配偶选择而开始出现雌雄差异。杨晓菁等[23]研究也表明，白头鹎枕部白色斑块大小存在季节性差异，在繁殖季节达到最大，符合饰羽假说。但是，饰羽的大小可能与鸟类个体的年龄有关[32]，郑作新等[24]认为白头鹎枕部近全白的个体为“老鸟”，本研究未排除年龄因素对结果造成的影响，白头鹎枕部白色斑块面积大小是否随年龄增加而变化仍需进一步确认。

白头鹎其他参数，包括体重、体长、跗蹠长、飞羽(第一飞羽，第二飞羽，第三飞羽等)、喙(喙峰长，嘴裂，喙宽，喙高)和翅膀面积均未出现显著差异，领雀嘴鹎的所有形态参数也同样不存在显著差异。繁殖竞争假说认为，体型越大的个体，在雄性对雌性交配权的竞争以及领土的守卫能力是有利的，雌性选择竞争中的优势者，有利于体型较大雄性个体的基因传播[20]，因此雄性竞争可以促使体重、体长、喙、跗蹠长等参数产生性二态[18,19]。而本研究中，这些指标不存在显著性差异的原因可能是两种鹎的雌雄个体在争夺交配权时存在相互选择，在雌性选择雄性个体部分形态指标的同时，雄性也会相应地选择雌性的某些指标(体重，体长等)，进而导致雄性个体的这些形态与雌性差异不显著。选型交配在部分鸟类，特别是一夫一妻制鸟类中已经得到证实[35,36]。但白头鹎与领雀嘴鹎性选择行为及特征尚不清楚，需要进一步研究。其次，在性选择对鸟类形态的作用小于自然选择时，较强的自然选择压力会降低性选择对雌雄形态分化的影响，导致雌雄差异不显著[10,37]，因此可能导致白头鹎体重、体长、喙等参数，领雀嘴鹎所有参数在本研究中雌雄差异不显著。此外，Székely等[20]对世界鸟类性二态的研究中发现，性二态的存在可能与亲缘关系有关，由于具有相似的繁殖策略与性选择机制，同科鸟种会在某些共同指标产生性二态，如部分织雀科(Ploceidae)鸟种的尾长与翅长存在性二态，且雄性极显著大于雌性;部分鹰科(Accipitridae)鸟种的体重、翅长和尾长存在性二态，且雌性极显著大于雄性。对比鹎科其他鸟种性二态研究发现，雄性的尾长与翅长均显著大于雌性[38,39,40]，但能否将这些参数作为鹎科鸟类性二态的共同特征，仍需深入研究。而两种鹎雌雄差异不同，也可能是二者亲缘关系较远的一种体现。对国内鹎科鸟类形态数值分类研究发现雀嘴鹎属与冠鹎属(Criniger)亲缘关系较近，与鹎属亲缘关系较远[21];Shakya等[22]对世界鹎科鸟类构建系统发育树也支持领雀嘴鹎与白头鹎亲缘关系远，且独立分支置度达100%，由此推测领雀嘴鹎与白头鹎在性二态上的不同也可能与二者亲缘关系较远有关。另外自然选择或性选择对种内不同种群的选择压力及强度或许不同，可能导致本研究中白头鹎指明亚种长沙种群性二态与杨晓菁等[23]研究结果略有不同，该研究中的尾长、翅长存在性二态，喙宽不存在性二态与本研究结果相同;跗蹠长、喙峰长、喙高和体长存在性二态，与本研究结果相异。最后，由于鸟类视觉与人眼对颜色的感知并不完全相同，过去部分基于人眼辨别雌雄羽色是否存在二态性的研究存在偏差，一些研究证实部分鸟类的性二态体现在羽毛在紫外光下反射出的颜色[41]，这也许出现在鹎中，因此应使用光谱进一步分析雌雄间羽色或亮度等是否存在差异。

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基金:国家自然科学基金项目(31501867,31770454);中央高校基本科研业务费专项(2572019BE05);东北林业大学大学生创新训练项目(201910225247)资助.