首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 肿瘤科论文 > 肺癌论文 > 非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的检测和临床意义的研究

非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的检测和临床意义的研究

2024-11-22 44 上传者：管理员

摘要：目的对非小细胞肺癌（NSCLC）患者中循环肿瘤细胞（CTCs）的表达情况进行检测，并探讨其与临床病理特征、肿瘤复发转移的关系。方法采集37例NSCLC患者和10例健康对照者外周血后，通过CanPatrolTM CTCs富集技术和多重RNA原位分析技术对外周血中的CTCs进行分离和检测，并探讨NSCLC患者在手术前的临床病理参数和CTCs阳性率之间的关系，进一步分析NSCLC患者术后的CTCs表达情况与肿瘤复发转移的关系。结果健康者的外周血中未检出CTCs,而NSCLC患者的CTCs阳性率高达75.7%（28/37）,并且CTCs的阳性率随NSCLC患者临床分期的增加而呈现一定的上升趋势。CTCs表达情况与患者自身的性别、年龄、分化程度无显著相关性，但与病理亚型有相关性，腺癌型NSCLC患者中的CTCs低于鳞癌型NSCLC患者。32例复查患者中有13例患者出现了复发转移，其中复发转移与未复发转移患者的CTCs阳性率分别为92.3%（12/13）和57.9%（11/19）,该差异具有明显的统计学意义（P<0.05）。结论检测NSCLC患者中CTCs的表达具有一定的临床参考意义，有望成为NSCLC诊断及预后评估的辅助手段。

关键词：
CTCs
NSCLC
循环肿瘤细胞
阳性率
非小细胞肺癌
加入收藏

肺癌是一种以咳嗽、胸痛、咳血等症状为主要表现的肺部恶性肿瘤，严重威胁人类生命健康。肺癌根据组织病理学特点不同分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC),尤以NSCLC居多，主要包括鳞癌和腺癌两种亚型[1-2]。我国烟民众多，近年来NSCLC患病人数有不断上升的趋势，虽然手术及放化疗等治疗手段的不断改进使得NSCLC患者病情病得到了较大改善，但仍有较多患者死于治疗后的局部复发和远处转移[3-4]。因此寻找一种更及时和更灵敏的检测手段反映NSCLC患者复发情况和转移程度非常重要。循环肿瘤细胞(CTCs)是一种来源于原发肿瘤或转移肿瘤的细胞，该细胞脱离基底膜后入侵组织基质并进入外周血液循环[5-6],在此过程中肿瘤细胞会发生上皮-间质转变(EMT),因此CTCs有三种不同的类型，分别是上皮细胞表型、间质细胞表型和上皮细胞与间质细胞混合表型[7-8]。多项研究[9-10]表明外周血中CTCs的检测对判断肿瘤是否转移具有重要的指导意义，因此成为临床研究的热点。本研究主要检测了NSCLC患者外周血中CTCs的表达情况，并探讨其与患者临床病理特征、肿瘤复发转移的关系。

1、对象和方法

1.1 研究对象

选取2021年10月至2022年9月在本院就诊的37例NSCLC患者，将其纳入实验组，包括男21例、女16例，平均年龄64岁。依据第八版国家NSCLC患者的TNM分期标准，其中Ⅰ期(早期)患者7例、Ⅱ期(中期)患者13例、Ⅲ期(中晚期)患者6例、Ⅳ期(晚期)患者11例。纳入标准：经过胸部CT扫描及其他组织病理学检查确诊为NSCLC的患者；年龄25～79岁；在进组前没有接受过其它抗肿瘤治疗；没有其他恶性肿瘤疾病史。同时选取我院10名健康人作为正常对照组，其中男6名、女4名，平均年龄61岁。两组受试者的性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05) 。

1.2 方法

1.2.1 外周血样本采集和CTCs的富集

使用8号采血针和EDTA抗凝采血管(购自于广州丹迈生物科技有限公司)收集受试者的肘正中静脉血5 mL,标记编号作为CTCs检测标本。每位受试者的血样收集好后，轻柔地将EDTA抗凝管进行上下颠倒10次来进一步混匀，随后放于室温保存，在24 h内完成CTCs的检测。运用益善生物技术股份有限公司提供的CanPatrolTMCTCs富集技术获得高纯度的CTCs, 即将采集好的外周血样品从EDTA抗凝管中转移到样本保存管内，加入红细胞裂解液后离心去除上清(离心台式低速离心机TDZ5-WS购自湖南湘仪动力测试仪器有限公司),并通过抗CD45免疫磁珠孵育去除白细胞后重悬于PBS中，加入4%的甲醛固定5 min, 再将细胞悬浮液转至过滤管中进行过滤，让CTCs富集在滤膜上。

1.2.2 多重RNA原位分析技术检测CTCs

将蛋白酶滴入上述富集了CTCs的滤膜上，然后用特异性间质型生物标记探针vimentin、twist, 上皮生物标记探针EpCAM、CK8/18/19以及白细胞标记物CD45进行杂交反应，在42 ℃温度下杂交反应2 h(电热恒温孵育箱购自上海一恒科学仪器有限公司)。未结合探针用洗脱液洗涤3次，再加入预扩增液和预扩增探针，置于42 ℃孵育20 min。将膜进行冷却，用洗脱液洗脱3次，然后与扩增溶液和扩增探针进行共孵育，进行信号扩大探针反应。随后加入Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 750和Alexa Fluor 488等三种荧光染料(均购自美国的Sigma公司),置于42 ℃孵育20 min, 然后用洗脱液进行洗脱，使用4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI,购自美国的Sigma公司) 进行细胞核染色5 min, 最后用自动化荧光扫描显微镜(BX53,购自日本的奥林巴斯公司)对样本进行观察。

1.3 统计学方法

采用SPSS20.0软件处理数据，采用χ2检验比较各组计量资料，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 CTCs的鉴定

上皮生物标记物EpCAM、CK8/18/19呈现阳性(红色),核染DAPI为阳性(蓝色),白细胞共同抗原(CD45)为阴性，且形态完整的细胞定义为上皮型CTCs; 间质生物标记物vimentin、twist呈现阳性(绿色),DAPI为阳性(蓝色),CD45为阴性，且形态完整的细胞定义为间质型CTCs; 上皮标记物阳性(红色),间质标记物阳性(绿色),DAPI阳性(蓝色),且形态完整的细胞定义为混合型CTCs。见表1和图1。

表1不同表型的CTCs的荧光颜色

图1NSCLC患者中不同表型的CTCs的荧光检测

2.2 NSCLC组和对照组CTCs阳性率的比较

10例健康者的外周血中均未检出CTCs, 而37例NSCLC患者的CTCs阳性率高达75.7% (28/37),差异有统计学意义(χ2=18.72,P=0.001)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期NSCLC患者的CTCs的阳性率分别是57.1%(4/7)、69.2%(9/13)、83.3%(5/6)和90.9%(10/11),随着NSCLC患者临床分期的增加而呈现一定的上升趋势，但并无显著性差异(χ2= 3.177,P=0.365)。

2.3 NSCLC患者CTCs表达与临床病理参数的关系

CTCs的表达与NSCLC患者性别、年龄、分化程度均无显著相关性(P>0.05);但与病理亚型有相关性，腺癌型NSCLC患者中的CTCs明显低于鳞癌型NSCLC患者(P<0.05)。见表2。

表2NSCLC患者CTCs表达与临床病理参数的关系[n(%)]

2.4 术后复查NSCLC患者的CTCs表达与复发转移的关系

手术后共32例NSCLC患者进行了复查，13例患者发生了肿瘤转移，其中仅有1列未检测到CTCs, 故CTCs阳性率为92.3%(12/13);而19例未发生肿瘤转移者中CTCs的阳性率不到57.9%(11/19),差异有统计学意义(χ2=4.522,P=0.033),这说明术后发生肿瘤转移的患者外周血中的CTCs阳性率远高于非转移患者。

3、讨论

近年来多项研究[11-13]表明CTCs的检测可有效地应用于多种肿瘤的早期诊断、化疗药物疗效的评估和肿瘤复发的监测等，加之肺癌的发病率和病死率位居众多肿瘤的前列，极大地危害患者的生命健康，因此本次研究检测了CTCs在NSCLC患者中的表达情况，由于NSCLC患者外周血中CTCs的数量非常少，通常在1亿个白细胞和500亿个红细胞中仅发现少量的CTCs, 故我们采用益善生物技术股份有限公司提供的CanPatrolTMCTCs富集技术来分离CTCs, 提高了CTCs的检出率，同时结合多重RNA原位分析技术对CTCs进行检测，研究结果发现NSCLC患者的外周血中存在上皮、间质和混合这三种不同表型的CTCs。此外，我们的研究结果表明NSCLC患者外周血中CTCs的阳性率高达75.7%,随着NSCLC患者临床分期的增加而呈现一定的上升趋势，而且腺癌型NSCLC患者中的CTCs表达明显低于鳞癌型患者，这预示着CTCs阳性率的升高和NSCLC的进展、病理分型有一定的相关性。然而，CTCs的表达与NSCLC患者性别、年龄和分化程度无关，这种现象超出了我们的预期，这表明CTCs与临床病理参数的关联比我们预想的要复杂，这一结果的出现可能原因是研究的样本量偏小。最后，对32例患者进行术后3个月的复查和随访，结果表明非复发转移者的CTCs阳性率明显低于复发转移者，这提示我们术后进行CTCs检测对预测NSCLC的转移复发有一定的指导意义，但CTCs与NSCLC患者预后的确切关系依赖于其它更大样本量和更长随访时间的研究。

综上所述，检测NSCLC患者中CTCs的表达具有重要的临床意义，有望成为NSCLC诊断及预后评估的重要手段，但CTCs检测作为一种新兴技术，目前其费用较高，检测时间较长[14],因此，降低CTCs检测成本，进一步提高灵敏度和方便程度，将会为NSCLC患者带来更多福音。

参考文献:

[3]裴尧,许骊欢,胡瑶蕊,等.ARF4通过EGFR通路调控非小细胞肺癌细胞增殖､迁移､侵袭和凋亡[J].现代肿瘤医学,2023,31(16):2965-2971.

[4]梁勇,廖波,李春林,等.腹腔镜下肝癌切除术与射频消融术治疗肝细胞癌的疗效观察[J].中国肿瘤临床与康复,2019,26(6):671-674.

基金资助:“十四五”成人继续教育科研规划课题(2023-517Y);湖南省卫生健康委2023年度科研计划课题(D202302048764);

文章来源:周碧兰,易宏辉,余艳宏.非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的检测和临床意义的研究[J].贵州医药,2024,48(11):1691-1693+1698.