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铂类药物对肺腺癌细胞PS+MPs释放量的影响

2025-05-06 64 上传者：管理员

摘要：目的分析铂类药物对肺腺癌源性PS+MPs释放量的影响。方法以两种人肺腺癌细胞系A549与H1299为研究对象，采用多个浓度的铂类药物对其进行干预。以CCK-8法检测细胞活力，采用流式细胞仪检测PS+MPs的释放量，比较不同药物、不同细胞系PS+MPs释放量的差异。结果随着铂类药物浓度的增加，两种细胞存活率明显降低（P<0.05）,且肿瘤细胞释放的PS+MPs占比也随之增加。在同一浓度DDP作用下，A549组释放PS+MPs数量占比明显高于H1299组。TP持续作用24 h后，高剂量组H1299组释放PS+MPs数量占比明显高于A549组。而相同细胞系在DDP和TP干预下，DDP干预组释放PS+MPs数量占比明显高于TP组。结论铂类药物能促进PS+MPs的释放，释放量可能与铂类药物类别以及肿瘤细胞种类有关。

关键词：
A549
H1299
NSCLC
磷脂酰丝氨酸
肺腺癌
铂类药
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肺癌是癌症死亡的首要原因,其中多数为非小细胞肺癌(nonsmallcelllungcancer,NSCLC),而肺腺癌又是NSCLC最常见的亚型[1-2]｡化疗仍是临床上治疗肺腺癌的基本手段[3]｡顺铂(cisplatin,DDP)作为首个被批准用于临床的铂类抗肿瘤药物,具有较强的抗肿瘤活性且抗癌谱广,是治疗NSCLC的首选药物[4]｡卡铂(carboplatin,TP)作为第二代铂类抗肿瘤药物,其作用机制与DDP相似,毒副作用小于DDP,多用于不能耐受DDP副作用病人的治疗[5]｡磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)是一种氨基磷脂,主要位于细胞质膜内侧｡当细胞凋亡时,PS由膜内表面翻转至外表面,并释放PS阳性微粒(micro-particles,MPs)｡研究发现,在肿瘤微环境中,肿瘤PS阳性微粒(PS+MPs)的释放会通过多种途径促进肿瘤细胞增殖与转移[6-8]｡本研究旨在分析铂类化疗药物对肺腺癌细胞A549和H1299细胞释放PS+MPs量的影响,为优化临床治疗方案提供参考｡

1、资料与方法

一､材料和试剂

人肺腺癌细胞株(H1299､A549)购自中国科学院上海细胞研究所,DMEM培养基(白鲨生物科技有限公司),1640培养基(Hyclone公司),胎牛血清(维森特生物技术有限公司),双抗､胰酶(碧云天生物公司),CCK-8试剂盒(白鲨生物科技有限公司),FITC-AnnexinV(Bioledgend),顺铂(江苏豪森药业股份有限公司,批号:国药准字H22022236),卡铂(齐鲁制药有限公司,批号:国药准字H20020181)｡

二､实验方法

1.细胞的复苏､培养与传代

将A549和H1299细胞复苏后,分别将其置于含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基与1640培养基中,在37℃､5%CO2环境中培养｡当观察到细胞长至约80%~90%密度时,采用胰酶消化传代,细胞传代完成后取对数增殖期的细胞进行后续实验｡

2.CCK-8法检测细胞活力及筛选药物浓度

正常培养肺腺癌细胞A549和H1299,取对数生长期细胞,按照100μL/孔､1×105个/mL的细胞浓度,均匀地接种到96孔板中,待细胞长至70%密度时,加入不同浓度的DDP(0､10､20､50､100､200μg/mL)和TP(0､100､200､400､600､800μg/mL)培养24h｡取出96孔板,弃去孔中的上清液,每孔加入100μLCCK-8混合液(CCK-8与DMEM培养基1∶9配制),37℃孵育1h后,震荡混匀,在酶标仪上450nm波长下检测其吸光度值(OD值)｡通过吸光度值,分析A549与H1299细胞在不同浓度药物作用下细胞的存活率并筛选出实验所需的药物浓度｡

3.收集PS+MPs

将对数生长期的A549和H1299细胞消化后,分别接种于10cm2大皿中｡待细胞长至约70%密度时,每种细胞系根据CCK-8的结果分别选取不同浓度的DDP(0､5､10､20μg/mL)和TP(0､100､200､400μg/mL)刺激24h,收集上清液,1000rpm,离心10min,弃沉淀,取上清,以14000rpm,4℃离心2min,再取上清14000rpm,离心60min取沉淀,经PBS洗涤3次后,Tyrode缓冲液中重悬后采用流式细胞术进行微粒含量检测

4.流式细胞术检测PS+MPs

将上述收集的PS+MPs悬浮液(5μL)重悬于35μLTyrode缓冲液中,与FITC-AnnexinV,室温孵育20min｡然后将每种悬浮液用150μLTyrode缓冲液稀释,并立即进行流式细胞术检测｡

三､统计学方法

数据采用GraphPad8.0进行统计分析｡符合正态分布的定量资料以x表示,采用独立样本t检验比较两组之间的差异,采用单因素方差比较多组之间的差异,并采用SNK-Q检验法进行多重比较分析｡以P<0.05为差异有统计学意义｡

2、结果

一､铂类药物抑制A549和H1299细胞的活力

为探讨铂类药物对肺腺癌A549和H1299细胞的影响,以不同浓度的卡铂与顺铂作用于A549和H1299细胞24h后,采用CCK-8法检测细胞活力,结果(如图1)所示｡DDP和TP对肺腺癌A549和H1299细胞的活力均有抑制作用｡比较各组细胞的存活率(见表1､2),发现两种肺腺癌细胞的存活能力均随着药物浓度的增加而降低;H1299细胞显示出比A549细胞更高的敏感性｡单因素方差分析结果显示,DDP和TP给药组的存活率明显小于0μg/mL组(P<0.01),A549组存活率明显高于H1299组(P<0.01)｡

图1铂类药物对肺腺癌细胞活力的影响

二､铂类药物促进肺腺癌细胞释放PS+MPs

为探讨铂类药物对肺腺癌细胞释放PS+MPs的影响,采用FITC-AnnexinV单染法流式细胞术检测PS+MPs的占比(图2､3)｡

表1不同剂量DDP对A549/H1299细胞存活率的影响(x

表2不同剂量TP对A549/H1299细胞存活率的影响(x

1.DDP对两种不同肺腺癌PS+MPs释放量占比的影响

不同浓度的DDP(以0μg/mL为对照组､10μg/mL为低剂量组､20μg/mL为高剂量组)作用24h后,A549细胞的PS+MPs释放量占比分别为:(56.63±1.25)%(对照组)､(62.17±2.35)%(低剂量组)､(70.77±2.05)%(高剂量组),组间差异均有统计学意义(P<0.05)(见图2A);不同浓度DDP作用于24h后,H1299细胞的PS+MPs释放量占比也不同,对照组､低剂量组､高剂量组分别为(29.60±1.90)%､(42.00±2.00)%和(58.30±1.06)%,组间差异均有统计学意义(P<0.05)(见图2B)｡

此外,同一浓度DDP下,A549与H1299释放量也不同,A549细胞的PS+MPs释放占比明显高于H1299组;其中对照组A549为(56.63±1.25)%､H1299为(29.60±1.90)%,低剂量组A549为(62.17±2.35)%､H1299为(42.00±2.00)%,高剂量组A549为(70.77±2.05)%,H1299为(58.30±1.06)%,组间差异均有统计学意义(P<0.05)(见图3A)｡

2.TP对两种不同肺腺癌PS+MPs释放量占比的影响

不同浓度的TP(以0μg/mL为对照组､200μg/mL为低剂量组､400μg/mL为高剂量组)作用24h后,A549细胞的PS+MPs释放量占比分别为:(24.33±3.76)%(对照组)､(31.17±1.15)%(低剂量组)､(36.93±1.62)%(高剂量组),其中低剂量组与高剂量组组间差异无统计学意义(P>0.05),但对照组与低剂量组以及对照组与高剂量组组间差异均有统计学意义(P<0.05)(见图2C);在不同浓度TP作用于24h后,H1299细胞的PS+MPs释放量占比也不同,对照组､低剂量组､高剂量组分别为(25.30±1.15)%､(31.80±1.32)%､(46.67±2.42)%,组间差异均有统计学意义(P<0.05)(见图2D)｡

图2铂类药物对肺腺癌细胞PS+MPs释放占比的影响

此外,同一浓度TP下,A549与H1299释放量在对照组与低剂量组未见明显差异,高剂量组H1299细胞的PS+MPs释放占比明显高于A549组;其中对照组A549为(24.33±3.76)%､H1299为(25.30±1.15)%,低剂量组A549为(31.17±1.15)%､H1299为(31.8±1.32)%,组间差异无统计学意义(P>0.05);高剂量组A549为(36.93±1.62)%,H1299为(46.67±2.42)%,组间差异有统计学意义(P<0.05)(见图3B)｡

图3顺铂与卡铂对两种肺腺癌细胞PS+MPs释放量的比较

3.DDP与TP对同种细胞系PS+MPs释放量的比较

根据临床上DDP与TP用药规格,通常DDP用药剂量为20mg/m2,TP用药量为400mg/m2,TP用药量为DDP用药的20倍｡参照这个倍比关系,研究发现A549经DDP与TP干预后释放PS+MPs数量占比不同,其中DDP干预后细胞的PS+MPs释放量占比明显高于TP(图3C):对照组DDP为(56.63±1.25)%､TP为(24.33±3.76)%,低剂量组DDP为(62.17±2.35)%､TP为(31.17±1.15)%,高剂量组DDP为(70.77±2.05)%｡TP为(36.93±1.62)%,组间差异均有统计学意义(P<0.05)｡类似的,H1299经DDP与TP干预后释放的PS+MPs占比亦有所不同,DDP干预后细胞的PS+MPs释放量占比明显高于TP(图3D):对照组DDP为(29.60±1.90)%､TP为(25.30±1.15)%,低剂量组DDP为(42.00±2.00)%､TP为(31.80±1.32)%,高剂量组DDP为(58.30±1.06)%､TP为(46.67±2.42)%,组间差异均有统计学意义(P<0.05)｡

3、讨论

肺癌是当前癌症死亡的主要原因,其五年生存率往往低于20%｡肺癌的病因病机复杂,其进展受多种因素影响[1,9]｡目前临床上对于NSCLC的治疗主要以化疗为主[10]｡DDP和TP是临床常用的铂类抗肿瘤药物｡本研究发现均能促进A549和H1299细胞释放PS+MPs,而DDP对肺腺癌细胞的PS+MPs释放量的促进作用高于TP｡

研究发现,化疗能够杀伤肿瘤细胞致其凋亡从而抑制肿瘤生长的同时,凋亡的肿瘤细胞会释放PS+MPs[11-12],因此作者推测铂类药物会促进肺腺癌细胞PS+MPs的产生｡为了进一步确定DDP和TP与细胞产生PS+MPs关系,我们通过流式细胞术研究DDP及TP干预A549和H1299细胞后的释放PS+MPs的占比｡结果显示,同种药物在不同浓度下,肺腺癌细胞释放PS+MPs的占比不同,且随着DDP或TP浓度的增加,肺腺癌细胞释放PS+MPs微粒的占比也随之增加｡

进一步的分析结果表明在相同浓度的药物作用下,两种肺腺癌细胞释放PS+MPs也不同｡当两种细胞A549和H1299都使用同一浓度DDP进行干预时,A549释放的PS+MPs占比大于H1299释放的PS+MPs｡当两种细胞都使用同一浓度的TP进行干预时,对照组与低剂量组,两种细胞的PS+MPs释放量占比无统计学差异;但高浓度TP干预时,H1299释放的PS+MPs占比大于A549释放的微粒数｡联系CCK-8实验结果,相同浓度TP干预A549和H1299细胞时,后者活力下降更明显,结果与流式细胞术检测得到的PS+MPs释放量占比趋势一致｡但同一浓度下的DDP作用于A549组的PS+MPs释放占比却高于同一浓度下DDP干预H1299组;该结果与CCK-8实验结果似乎存在矛盾,这可能与细胞凋亡程度不同时,其释放的微粒可能也不同有关,但具体原因还有待进一步深入研究｡此外,研究发现相同细胞系在相对同一参照浓度的DDP或TP干预下,无论是A549组还是H1299组,其DDP干预组释放PS+MPs数量占比都明显高于TP组;提示DDP对肺腺癌细胞干预作用可能强于TP,与文献结果一致[13]｡

综上所述,DDP和TP能够有效抑制肺腺癌细胞活力,且H1299细胞对铂类药物敏感性强于A549,但铂类药物抑制肺腺癌活力的同时还能促进PS+MPs的释放,且释放量与铂类药物类别以及肿瘤细胞种类有关｡下一步将针设计实验对PS+MPs进行干预,观察对肿瘤预后进展等影响｡

参考文献:

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基金资助:安徽省高等学校省级自然科学研究重点项目(2022AH050519);中医药防治肺系重大疾病应用转化安徽省重点实验室开放课题基金资助(2024ZYFBAHKLA12);

文章来源:陈淑君,吴阳培,田家铭,等.铂类药物对肺腺癌细胞PS+MPs释放量的影响[J].临床肺科杂志,2025,30(05):667-671.