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mNGS在诊断痰涂阴性肺结核合并真菌感染中的应用

2025-05-06 49 上传者：管理员

摘要：目的探讨对支气管肺泡灌洗液(BALF)进行病原宏基因组高通量测序(mNGS)在痰涂阴性肺结核合并真菌感染患者中的诊断价值。方法选取湖南省胸科医院收治的疑似痰涂阴性肺结核患者200例。最终临床诊断肺结核患者124例，非肺结核患者76例。患者均行BALF常规检测和BALF mNGS检测，分别比较不同检查方法对结核分枝杆菌(MTB)及真菌的诊断效率，分析痰涂阴性肺结核合并真菌感染的危险因素。结果痰涂阴性患者行BALF mNGS检测MTB的灵敏度是58.1%,高于BALF涂片16.1%和BALF培养20.2%,差异有统计学意义(P<0.05);BALF mNGS检测真菌的灵敏度是94.4%,高于BALF培养55.6%,差异有统计学意义(P<0.05);痰涂阴性肺结核患者合并真菌感染率12.9%,非肺结核患者合并真菌感染率2.6%,差异有统计学意义(P<0.05);糖尿病病史、使用抗生素时间>14天与痰涂阴性肺结核合并真菌感染显著相关，差异有统计学意义(P<0.05)。结论疑似痰涂阴性肺结核，伴有糖尿病病史或使用抗生素时间>14天的患者行BALF mNGS检测可以提高诊断效率。

关键词：
MTB
宏基因组
痰涂阴性
肺泡灌洗液
肺结核
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肺结核是由结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis,MTB)引发的肺部慢性炎症,患者多出现营养不良,加上MTB长期刺激肺部,为滋生真菌创造了有利条件｡痰涂阴性肺结核合并真菌感染的患者大多病程较长,病原体隐匿,临床症状､体征无明显特异性,易被漏诊和误诊｡免疫力低下的患者合并真菌感染,使MTB侵袭性更大,对痰涂阴性的患者造成更大的伤害[1]｡因此,我们需要找到一种能快速明确诊断的方法,尽早进行治疗｡宏基因组高通量基因测序(Metagenomicsnext-generationsequencing,mNGS)能够直接对核酸进行高通量测序,客观的检测临床样本中的多种病原微生物,缩短检测时间,提高诊断效率[2]｡本研究对行mNGS检测的疑似痰涂阴性肺结核患者进行回顾性分析,旨在探讨mNGS在涂阴肺结核合并真菌感染中的诊断效能｡

1、资料与方法

一､研究对象

选取2023年6月-2024年6月我院收治的疑似肺结核痰涂阴性患者200例,最终临床诊断为肺结核患者124例,非肺结核患者76例｡肺结核诊断标准参考《肺结核诊断》(WS288—2017)[3],肺部真菌感染标准参考《肺真菌病诊断和治疗专家共识》[4]｡本研究通过湖南省胸科医院医学伦理委员会批准(快LS2024103001)｡

二､纳入标准

1.临床表现和影像学表现疑似肺结核患者,无痰或痰培养1次且痰涂片抗酸染色检测3次都是阴性｡2.同意接收支气管镜检查及支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolarlavagefluid,BALF)的常规检测和mNGS检测｡3.年龄≥18周岁｡排除标准:1.临床资料不全者｡2.诊断不明确者｡3.有严重心肝肾器质性疾病等｡4.妊娠妇女､哺乳妇女等｡5.行mNGS检测BALF标本质量不达标｡

三､病原菌检测方法

1.BALF留取方法参考《肺部感染性疾病支气管肺泡灌洗病原体检测中国专家共识(2017年版)》[5]采集患者的BALF作为检测样本,采集过程确保样本的纯净度,并将采集到的样本进行离心､去杂质等处理,以去除非病原微生物成分,提高检测准确性｡

2.BALF传统检测涂片按照《结核分枝杆菌药物敏感性试验标准化操作程序及质量保证手册》[6]中的标准化操作程序进行;培养采用BACTECMGITTM960分枝杆菌快速培养法｡

3.BALFmNGS检测将1.5~3mLBALF样本存入无菌冻存管中送艾迪康医学检验实验室进行检测｡采用微量样品基因组DNA提取试剂盒,提取样本中的核酸,对提取的核酸进行纯化,去除抑制剂和杂质｡将纯化后的核酸进行片段化,并连接上测序接头和标签,构建出测序文库｡采用高通量测序技术对文库进行测序,获取大量的核酸测序数据｡对测序数据进行质量控制､比对和注释,识别出样本中病原微生物种类和数量｡根据数据分析结果,结合患者的临床信息和样本特征,进行结果解读和诊断｡

4.测序结果判定标准参考《呼吸系统感染中宏基因组测序技术临床应用与结果解读专家共识》[7],MTB在检出至少1条特异性序列时,即有可能提示感染;MTB特异性序列数在细菌列表中排名前20位可定义阳性｡

四､统计学方法

采用SPSS22.0软件进行数据分析,以最终临床诊断为参考标准,计数资料用n(%)表示,用受试者工作特征曲线(Receiveroperatingcharacteristiccurve,ROC)对不同诊断方法进行分析,采用卡方检验进行组间分析,P<0.05为差异有统计学意义｡

2、结果

一､不同检测方法诊断肺结核感染的比较

对患者行MTB检测情况如下(表1),BALF涂片､BALF培养､BALFmNGS的灵敏度分别是16.1%､20.2%､58.1%;特异度分别是88.4%､100.0%､100.0%;阳性预测值分别是66.7%､100.0%､100.0%;阴性预测值分别是42.2%､43.4%､59.4%｡

受试者工作特征曲线示,BALF涂片､BALF培养､BALFmNGS诊断肺结核感染的AUC分别为0.515(95%CI:0.443~0.586)､0.601(95%CI:0.529~0.669)､0.790(95%CI:0.727~0.845)｡三者AUC差异有统计学意义,其中BALFmNGS高于BALF涂片(Z=9.308,P<0.001),BALFmNGS高于BALF培养(Z=8.665,P<0.001)｡

表1不同检测方法诊断MTB比较

二､BALFmNGS检出病原微生物结果

肺结核组与非肺结核组的病原微生物检测情况(表2)｡在肺结核组(n=124),合并真菌感染16例(12.9%),合并其他细菌感染36例(29.0%),其他病原体感染8例(6.5%);在非肺结核组(n=76),患者以细菌感染为主,细菌感染48例(63.2%),真菌感染2例(2.6%),其他病原体感染10例(13.2%)｡肺结核组的真菌感染率比非肺结核组高,差异有统计学意义｡

表2BALFmNGS检测病原微生物情况[n(%)]

三､不同检测方法诊断真菌感染的比较

对患者行真菌检测情况如下(表3)｡G试验､G/GM联合试验､BALF培养､BALFmNGS的灵敏度分别是83.3%､88.9%､55.6%､94.4%;特异度分别是91.0%､96.8%､99.5%､98.9%;阳性预测值分别是45.5%､72.7%､90.9%､89.5%;阴性预测值分别是98.4%､98.9%､95.8%､99.5%｡

受试者工作特征曲线示,G试验､G/GM联合试验､BALF培养､BALFmNGS的AUC分别为0.963(95%CI:0.939~0.986)､0.989(95%CI:0.977~1.000)､0.806(95%CI:0.664~0.947)､0.997(95%CI:0.991~1.000)其中,BALFmNGSAUC高于G试验(Z=3.421,P=0.001);BALFmNGS高于BALF培养(Z=2.147,P=0.032)｡

四､真菌独立危险因素统计

对16例涂阴肺结核合并真菌感染患者进行危险因素统计分析(表4)｡病程>3年的患者2例(12.5%),有糖尿病病史患者6例(37.5%),使用抗生素时间>14天患者9例(56.3%),使用糖皮质激素>7天患者1例(6.3%),肺部影像有空洞/纤维化/累计≥3个肺叶的患者3例(18.8%),合并其他严重疾病2例(12.5%)｡采用卡方检验分析显示,有糖尿病病史､使用抗生素时间>14天与涂阴肺结核合并真菌感染显著相关,差异有统计学意义(P<0.05)｡

3、讨论

肺结核是由MTB感染肺部所引起的慢性传染病,由于MTB寄居在细胞内,临床上常常出现病原学检查结果阴性｡痰涂阴性肺结核是指传统的痰培养1次且痰涂片抗酸染色检测3次都是阴性,但根据患者影像学表现､临床症状､免疫学检测及其他检测结果认定为临床诊断的肺结核｡mNGS直接从样本中提取遗传物质片段,进行高通量测序,测序速度快,从而能检测样本中包括MTB在内的所有病原微生物,在肺结核的诊断中有一定价值[8]｡

BALF是一种对肺无侵袭性损害的肺内标本,可强化抗酸杆菌及培养的阳性率[9],且mNGS检测肺内标本的灵敏度高于肺外标本[10]｡本研究对痰涂阴性或者无痰患者行BALFmNGS,发现BALFmNGS的灵敏度显著高于BALF涂片和培养,这一结果跟既往研究一致[11]｡抗酸染色虽经济快捷,但敏感度低,特异性也不高;常规培养虽然特异性高,但培养周期长,敏感性低｡mNGS检测诊断MTB感染的总体灵敏度高于涂片法､培养法,对痰涂阴性肺结核患者mNGS比传统方法具有更高的诊断价值[12-13]｡但由于痰涂阴性肺结核患者结核分枝杆菌排放量少,细胞壁厚,样本中核酸序列较少,在未检测到MTB的情况下,也不能排除感染MTB的可能性,还需要结合临床及其他实验室检查综合诊断｡因mNGS费用较高,本研究未对痰涂阳性患者开展mNGS检测,故结果中缺乏痰涂阴性和痰涂阳性mNGS检测的对比结果｡

表3不同检测方法对诊断真菌感染患者的比较

表4涂阴肺结核合并真菌感染危险因素分析[n(%)]

本研究发现涂阴肺结核合并真菌感染占12.9%,高于非肺结核组｡肺结核患者营养状况差,机体免疫功能下降,MTB侵犯肺黏膜､破坏肺组织;呼吸道菌种及菌落密度发生紊乱,导致条件致病菌增加[14],合并真菌感染增多｡而合并真菌感染又降低了MTB活性,抑制分枝菌酸,使MTB抗酸能力减弱或消失,致肺结核患者痰涂阴性增加｡本研究发现有糖尿病病史､使用抗生素时间>14天与涂阴肺结核合并真菌感染显著相关｡合并糖尿病的患者因血糖持续升高,造成单核吞噬细胞系统功能障碍,免疫细胞功能下降,同时蛋白质代谢紊乱,合并真菌感染的几率增加｡长期使用抗生素会抑制正常菌群生长,导致菌群失调,减低定植抵抗力,甚至促进真菌的生长｡NTM也好发于有结构性肺病､营养不良､免疫力低下的人群,抗酸染色也为阳性,常见的NTM可结合临床影像学特征,通过mNGS等进行鉴别｡而大多数NTM致病性比MTB弱,有些患者可通过自身免疫系统清除细菌后恢复｡

由于肺结核合并真菌感染时,在症状､体征及X线表现上无特殊性,在临床诊断和鉴别诊断有一定困难｡本研究诊断真菌感染结果跟既往研究一致[15],BALFmNGS､G试验､G/GM联合试验的灵敏度均与BALF培养有显著差异｡G实验适用于除隐球菌和毛霉菌外的所有深部真菌感染的早期诊断,虽然有较好的灵敏性和特异度,但不能确定真菌感染种类;GM试验仅适用于侵袭性曲霉菌感染的早期诊断,对其他真菌检测无效;G试验和GM试验联合检测可提高对侵袭性真菌感染的诊断｡但二者都存在假阳性和假阴性结果,仍需结合临床表现及其他检测综合判断是否存在真菌感染｡BALF培养优势在于能明确真菌种属,并能检测出混合感染,但是检出率低且耗时长｡mNGS可对病原体的基因组进行测序,对耐药基因进行检测,不但更易检出混合性病原体感染,对真菌及其分型也具有明显优势,还能提供耐药参考药物[16]｡本研究的BALFmNGS诊断真菌感染的灵敏度､特异度､阳性预测值及阴性预测值分别是94.4%､98.9%､89.5%､99.5%,说明BALFmNGS诊断真菌感染效能高,但不排除样本数量少的缘故｡

mNGS检测能一次性完成对混合感染的检测,行BALFmNGS检测有较高的临床价值[17],灌洗术的激惹作用可提高mNGS的检出率[18]｡对有糖尿病病史､使用抗生素时间>14天的痰涂阴性肺结核或无痰患者,可行支气管肺泡灌洗术取BALF进行mNGS检测｡mNGS检测不仅提高了MTB的检出率,还能一次性快速准确得发现合并感染情况,了解耐药性,明确真菌种属,指导临床用药,做到及时正确治疗,缓解病人痛苦,缩短住院时间｡但mNGS检测的微生物可能是气管正常菌群､样本污染､一次性定植､也可能是设备残留的污染,不能对报告所列全部病原体进行覆盖治疗,检测到的病原体还需要跟临床症状､影像学特点及传统培养等方法相互印证[19]｡虽然mNGS检测的优势明显,但费用较高,不用于病情较轻者或者典型者｡mNGS作为一种先进准确快速的病原诊断技术,在临床上还需要继续探讨对患者行mNGS检测的最优情况｡

参考文献:

[2]王英盼,厉银平.mNGS在肺部感染病原学中的诊断价值及应用分析[J].中国医学工程,2024,32(4):25-28.

[3]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.中华人民共和国卫生行业标准:肺结核诊断:WS288—2017[S/OL].(2017-11-09)[2018-06-01].

[4]中华医学会呼吸病学分会感染学组,中华结核和呼吸杂志编辑委员会.肺真菌病诊断和治疗专家共识[J].中华结核和呼吸杂志,2007,30(11):821-834.

[5]中华医学会呼吸病学分会.肺部感染性疾病支气管肺泡灌洗病原体检测中国专家共识(2017年版)[J].中华结核和呼吸杂志,2017,40(8):578-583.

文章来源:唐彬,黄屹.mNGS在诊断痰涂阴性肺结核合并真菌感染中的应用[J].临床肺科杂志,2025,30(05):767-770+782.