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IL-35在非小细胞肺癌患者中的表达

2020-09-23 309 上传者：管理员

摘要：目的:了解白细胞介素-35(IL-35)在非小细胞肺癌(NSCLC)患者和健康人中表达的差异。方法:采用ELISA法分别检测80例NSCLC患者及20例健康体检者血清中IL-35水平,采用RT-PCR测定80例NSCLC患者肺癌组织及癌旁组织中的IL-35mRNA的表达,并对检测结果进行比较分析。结果:NSCLC患者血清中IL-35水平显著高于健康体检者(P<0.05),其在肺癌组织内的IL-35mRNA表达比癌旁组织高(P<0.01)。结论:IL-35与NSCLC侵袭、转移和预后相关,其对NSCLC的免疫逃逸有促进作用。

关键词：
IL-35
NSCLC侵袭
肺癌
表达
非小细胞肺癌
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烟草、汽车尾气、雾霾等诱因导致的肺癌在世界范围内造成严重的不良影响,其发病率和死亡率持续升高[1]。肺癌的治疗方案包括手术、放疗和化疗,以及使用免疫调节抗体,遗憾的是只有16%的肺癌患者能在早期阶段被诊断出来[2]。我国肺癌患者的5年相对生存率为16.1%,在所有恶性肿瘤中排名倒数第3位。肺癌预后较差与多数患者诊断时临床分期较晚有关。美国的统计数据显示,肺癌初次诊断时为局部、区域、远处转移的患者所占比例分別为16%、22%和57%,相应的5年相对生存率分别为56%、29%和5%[3]。依据病理学分类,肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC),后者约占所有肺癌病例的85%[4]。不幸的是干预治疗成功率有限。一个原因可能是肿瘤细胞激活体内不同的免疫抑制途径,导致效应T细胞抑制抗肿瘤免疫应答,其可以根据宿主的遗传背景而变化。白细胞介素-35(interleukin-35,IL-35)是一种能在机体免疫系统中发挥重要作用的免疫抑制因子,可诱导Treg细胞参与肿瘤免疫逃逸[5]。IL-35于2007年第一次被定义,是IL-12细胞因子家族成员,由IL-12p35亚基和IL-27β亚基Epstein-Barr病毒诱导3(Epstein-Barrvirusinduced3,EBI3)组成的IL-12细胞因子家族的异二聚体[6],已被证明具有免疫抑制活性,这种免疫抑制活性在IL-12家族的其他成员中不存在[7],它主要由抗原呈递细胞样致耐受性树突状细胞表达[8],可直接抑制T细胞的增殖和功能,还通过产生有效的IL-35诱导型抗体(iTr35)来扩展调节反应以促进对感染的耐受性[9]。其他新认识的IL-35细胞来源是CD8+Tregs和B调节(Bregulatory,Breg)细胞[10]。IL-35可以预防自身免疫性疾病,更好地了解IL-35的表达和调控机制将有利于开发针对这些疾病的新型免疫疗法[11]。本研究检测了NSCLC患者肺癌组织与癌旁组织中IL-35mRNA的表达情况,以及NSCLC患者和健康受试者血清中的IL-35水平,现报告如下。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取我院2017年7月至2018年12月收治的80例经手术治疗病理诊断为NSCLC患者为研究对象,其中男45例、女35例,年龄(46.2±10.6)岁。在取样前详细记录并核对相关资料,如患者姓名、性别、年龄、住院号、联系方式、发病时间、病理诊断、肿瘤部位、肿瘤大小、肿瘤TNM分期、是否有淋巴转移、手术时间与方式、原发或复发等。取得患者的癌组织及癌旁组织(距肿瘤组织>5.0cm),并收集手术7d后患者血清。纳入标准:所纳入的患者手术前均未经抗肿瘤治疗;所有患者均经病理或细胞学诊断为NSCLC,病历完整且采样前没有进行过放疗、化疗、免疫抑制剂等影响试验结果的治疗。排除标准:原发肿瘤的肺部转移者;伴有其他并发症如肺部炎症、糖尿病等患者;伴有免疫性疾病患者;伴有血液系统疾病患者;随访资料不完善的患者。选取同期来我院体检的健康人群20例作为对照组。

1.2主要仪器与试剂

试验仪器有-80℃超低温冰箱、96孔酶标仪、手持式匀浆机、Eppendorf低温离心机、旋涡震荡仪;反转录的Trizol和荧光定量试剂SYBR购自Takara公司,三氯甲烷、异丙醇、75%乙醇购自国药集团化学试剂有限公司,ELISA检测试剂盒购自北京达科为生物技术有限公司。其他涉及仪器或试剂将在后文表述。

1.3方法

1.3.1测定血液样品

抽取受试者空腹外周静脉血5ml(用非抗凝真空管)。室温静置1h后6000r/min、4℃离心15min,取上清液于2mlEP管内,放4℃冰箱暂时保存待检,或置于-80℃低温保存备用。用ELISA法按试剂盒说明书检测患者血清IL-35水平。根据双抗体夹心ELISA法,用鼠抗包被酶标板将采集的样品或者试剂盒提供的人IL-35标准品与抗体结合,此时抗体已经包被在ELISA板上,游离成分将在结合之后被冲走。按试验设计的顺序,将以生物素标记的人IL-35抗体和以辣根过氧化物标记的过氧化物酶加入其中,人IL-35与其抗体结合,生物素与过氧化物酶结合,加入TMB显色底物反应后加入终止液,ELISA板内液体变黄色此过程避光,在450nm波长处用酶标仪检测其OD值,GraphPad绘制标准曲线计算IL-35浓度。

1.3.2组织样品检测方法

手术摘除NSCLC患者的病灶后,切取适当位置适当体积的癌旁肺组织,立即送检提取总RNA;取等量大小组织块,用手持式匀浆机打碎后,采用Trizol法提取组织总RNA。提取RNA后,用紫外分光光度计检测其纯度和浓度,取吸光度为1.8～2.0之间的RNA样品用Takara的一步法反转录试剂逆转录成cDNA,其反应条件为37℃15min,85℃10s,4℃∞。用StepOnePlusReal-TimePCRSystem荧光定量仪进行扩增,按照TakaraTBGreen说明书配相对定量体系20μl:TBGreenpremixExTaqⅡ10.0μl,上游引物0.8μl,下游引物0.8μl,ROX0.4μl,双蒸水6.0ul,cDNA2.0μl。反应条件为95℃30s、95℃5s、60℃30s,共40个循环,在60℃处采集荧光信号。分析方法采用比较Ct值法:相对表达倍数用2-ΔΔCt计算,Ct=ΔCt样本-ΔCtNC=[(样本目的基因Ct值-样本内参基因Ct值)-(对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值)]。RT-PCR分析基因表达,其引物EBI3、P35及内参参考文献[12]。

1.4统计学方法

本研究使用GraphPad进行统计学分析,计量资料以ˉx±s

表示,两组比较采用t检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1血清IL-35检测结果

NSCLC患者血清中IL-35的水平高于健康体检者[(35.68±2.73)ng/mlvs(17.83±3.85)ng/ml)],差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2IL-35mRNA检测结果

NSCLC患者肺癌组织中IL-35mRNA的表达水平高于癌旁组织[(36.180±0.815)ng/mlvs(13.650±0.192)ng/ml)],差异有统计学意义(P<0.01)。

3、讨论

目前NSCLC患者5年生存率依旧很低,对患者及时有效的治疗很重要。针对检测点抑制剂的免疫治疗,目标是在肺癌中靶向PD-L1和程序性细胞死亡-1(PD-1)分子已经显示出一些有希望的结果[15],但治疗成功率仍然很低。最近有研究描述强免疫抑制微环境的存在,其特征在于TGFβ诱导的Treg转录因子特征基因Foxp3的表达,并在肺肿瘤细胞的周围微环境中分泌[16]。IL-35已被证明具有免疫抑制功能,支持Treg和Breg细胞中的Foxp3,从而沉默细胞因子和免疫球蛋白产生的抗肿瘤免疫应答[17]。

IL-35是免疫抑制的IL-12家族的一部分,IL-12家族是一种细胞因子家族,包含抗肿瘤类细胞因子IL-12或IL-27,人们开始研究其转录水平的成分调节。IL-35阳性细胞与NSCLC患者的TN区域中的Foxp3/β-肌动蛋白蛋白质水平相关。有研究对Foxp3和IL-35进行免疫组化双标记,发现NSCLC患者双阳性即IL-35与Foxp3均阳性细胞增加。我们注意到这两种蛋白质的共定位代表了产生IL-35的细胞如巨噬细胞和响应细胞如Treg细胞之间的严格相互作用的可能性。IL-35与NSCLC患者肺部TU区域的免疫抑制有关。

本研究结果表明,NSCLC患者血清中IL-35水平显著高于健康体检者(P<0.05),肺癌组织中的IL-35mRNA表达比癌旁组织高(P<0.01),说明IL-35与NSCLC侵袭、转移和预后相关,其对NSCLC的免疫逃逸有促进作用,提示抑制IL-35的表达有可能是治疗NSCLC的新途径,今后尚需更多的研究来验证。

参考文献：

[1]贾佳,张智慧.细胞学标本在非小细胞肺癌基因检测中的应用[J].中国肿瘤临床与康复,2017(3):370-372.

[3]国家癌症中心.国家癌症中心:2018年全国最新肺癌报告[R/OL].[2019-08-25].

[4]王丽.晚期非小细胞肺癌的药物治疗进展[J].上海医学,2017(2):122-125.

[7]黄昌胜,沈关心.IL-35在机体对HBV感染免疫应答中的调节作用[J].医学分子生物学杂志,2017,14(4):246-248.

[13]刘宝兴,李印,马海波,等.术中发现胸膜转移扩散的非小细胞肺癌外科手术治疗效果[J].中华胸心血管外科杂志,2017,33(9):522-526.

[15]魏智民,陈寅,焦顺昌.免疫检查点抑制剂在肺癌治疗中的应用研究进展[J].中华老年多器官疾病杂志,2018,17(5):383-388.

刘春齐,万小云,张耀森,江俊伟.IL-35在非小细胞肺癌患者中的表达[J].现代临床医学,2020,46(05):335-336+341.