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miR-135b联合HE4、CEA、CA153检测对NSCLC的诊断价值

2020-10-13 160 上传者：管理员

摘要：目的:研究miR-135b联合人附睾分泌蛋白4(HE4)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原153(CA153)检测对早期非小细胞肺癌(NSCLC)的诊断价值。方法:选取本院2017年3月至2019年3月期间收治的早期(Ⅰ-Ⅱ期)NSCLC患者78例作为研究对象,另选取同期健康志愿者102例作为对照组。实时荧光定量(RT-qPCR)法测定miR-135b表达水平,电化学免疫发光(ECLIA)法测定HE4、CEA、CA153表达水平,绘制工作特征(ROC)曲线评估miR-135b联合HE4、CEA、CA153检测对早期NSCLC的诊断价值。结果:与对照组相比,早期NSCLC组miR-135b、HE4、CEA、CA153表达水平显著升高(P<0.05),临床病理特征分析发现,miR-135b、HE4、CEA、CA153表达水平与年龄、性别、病理类型无关,Ⅱ期NSCLC患者表达水平显著高于Ⅰ期患者(P<0.05)。根据诊断早期NSCLC的ROC曲线图可得知,miR-135b、HE4、CEA、CA153诊断早期NSCLC曲线下面积分别为0.78(95%CI:0.710～0.836)、0.77(95%CI:0.698～0.826)、0.80(95%CI:0.732～0.854)、0.81(95%CI:0.743～0.863),截断值分别为1.47/U6、23.82pmol/L、5.82ng/mL、10.31ng/mL。相比于miR-135b单项检测和HE4、CEA、CA153三者联合检测,四者联合检测准确度显著升高(P<0.05)。结论:miR-135b联合HE4、CEA、CA153检测能够提高单独检测早期NSCLC的灵敏度、特异度、准确度。

关键词：
miR-135b
NSCLC
人附睾分泌蛋白4
癌抗原153
癌胚抗原
肺癌
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非小细胞肺癌是全球性癌症患者死亡的主要病因之一,早期临床上一般表现为低热、痰中带血、胸部胀痛等症状,中晚期患者表现为咳血、持续性咳嗽、呼吸困难[1,2]。由于NSCLC患者早期症状不明显,大多患者治疗时病情已进入中晚期,导致患者治疗困难,预后差,近5年生存率约为15%,若及时发现并治疗其5年生存率可增至75%[3]。因此如何早期诊断NSCLC成为改善患者生存的关键。微小RNA参与肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭和迁移进程,与肿瘤发生发展相关[4]。研究发现miR-135b在非小细胞肺癌中高表达,可促进非小细胞肺癌细胞侵袭和迁移[5]。人附睾分泌蛋白4在正常机体中低表达,在肿瘤组织中高表达,是研究广泛的肿瘤标志物,有研究报道其是卵巢上皮癌的血清标志物[6]。癌胚抗原是酸性蛋白的一种,多表达在肿瘤组织中,有研究指出,CEA在不同分期肺癌患者血清中水平不同,随着肺癌病情严重其水平逐渐上升,诊断肺腺癌灵敏度较高[7]。癌抗原是人类胚胎抗原特异性决定簇上的酸性糖蛋白,血液中其水平与癌细胞数呈正相关[8]。有研究发现CA153在肺癌患者血清中高表达,诊断灵敏度为53.20%,特异度为86.35%,符合率为73.50%[9]。但是miR-135b、HE4、CEA、CA153单独检测往往因灵敏度或特异性使之应用受限,因此本研究拟探究miR-135b联合HE4、CEA、CA153检测对早期非小细胞肺癌的诊断价值。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取本院2017年3月至2019年3月期间收治的早期(Ⅰ-Ⅱ期)NSCLC患者78例,其中男性46例,女性32例;年龄40.18～75.26岁,平均年龄(58.46±3.48)岁;其中Ⅰ期54例,Ⅱ期24例;腺癌43例,鳞癌35例;肿瘤直径1.62～5.74cm,平均直径(3.55±1.37)cm。纳入标准:①患者未接受相关治疗;②经病理诊断符合标准;③患者病理资料完整。排除标准:①伴有肾、肝、心功能受损患者;②伴有精神疾病患者;③长期使用免疫抑制剂和固醇类激素患者;④患有其它癌症患者。此外选取同期前来体检的健康志愿者102例作为对照组,其中男性58例,女性44例;年龄43.09～74.79岁,平均年龄(59.12±3.58)岁。所有受试者及家属均对本研究知情,并签订临床研究协议书,两组受试者年龄、性别等差异无统计学意义(P>0.05),本研究经本院道德伦理委员会批准通过,符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2试剂和仪器

RNA提取试剂盒(货号:R1200-100)购自北京索莱宝科技有限公司;反转录PCR试剂盒(货号:BDIT0035)购自北京博奥龙免疫技术有限公司;miR-135b引物序列由美国金唯智公司合成;i2000型全自动电化学发光分析仪及配套试剂购自美国雅培公司。MiniAmpPCR仪购自美国赛飞世尔科技公司。

1.3判定标准

采用受试者工作特征曲线评估miR-135b、HE4、CEA、CA153诊断早期NSCLC的最佳截断值,大于或等于截断值判定诊断早期NSCLC为阳性,小于截断值判定诊断早期NSCLC为阴性,四者联合诊断,其中一项指标为阳性,则诊断早期NSCLC为阳性。

1.4样品采集和保存

所有受试者均取清晨空腹血6mL,室温静置30min,4℃离心分离血清,置于-20℃冰箱中保存,1周内完成检测。

1.5RT-qPCR检测受试者血清中miR-135b表达水平

使用RNA提取试剂盒提取血样总RNA,用反转录试剂盒行反转录,反转录体系由0.15μLdNTPs(100mmol/L)、1.50μL10×ReverseTranscriptionBuffer、1.00μLMultiScribeReverseTranscriptase、3.00μLRTprimer、5.00μL总RNA、0.19μLRNaseInhibitor、4.16μL无菌注射用水组成。miR-135b及内参U6引物序列如下,miR-135b上游引物序列:5'-GTCTCGAGCAGTGCAGGGTCCGAGG-3',下游引物序列:5'-TAAAGCTTCTGGATACGACCACATA-3';内参U6上游引物序列:5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3',下游引物序列:5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。PCR扩增体系由4.00μL无菌注射用水、10.00μLTaqManUniversalMasterMixⅡ、1.00μLTaqmanMicroRNAAssay、5.00μL反转录产物组成。PCR扩增条件:95℃激活10min,95℃变性15s,60℃延伸1min,进行扩增30个循环。用2-△△Ct法对Ct值进行处理,比较不同组患者血清中miR-135b表达水平。

1.6测定血清中HE4、CEA、CA153表达水平

采用电化学免疫发光法测定HE4、CEA、CA153表达水平,具体操作严格按照说明书执行。

1.7统计学分析

用SPSS22.0软件进行数据处理和分析,HE4、CEA、CA153表达水平以平均数±标准差的形式表示,两组比较行t检验,多种比较行单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。ROC曲线用MedCalc软件进行绘制和分析。P<0.05说明差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组受试者血清miR-135b、HE4、CEA、CA153表达水平

与对照组相比,早期NSCLC组miR-135b、HE4、CEA、CA153表达水平显著升高(P<0.05),详见表1。

2.2血清miR-135b、HE4、CEA、CA153表达水平与早期NSCLC临床病理特征的关系

不同年龄、性别、病理类型的早期NSCLC患者miR-135b、HE4、CEA、CA153表达水平差异无统计学意义(P>0.05),Ⅱ期的早期NSCLC患者miR-135b、HE4、CEA、CA153表达水平高于Ⅰ期患者,两者相比差异有统计学意义(P<0.05),详见表2。

2.3血清miR-135b、HE4、CEA、CA153表达水平对早期NSCLC的诊断效能

根据ROC曲线图可得知,miR-135b、HE4、CEA、CA153诊断早期NSCLC曲线下面积分别为0.78(95%CI:0.710～0.836)、0.77(95%CI:0.698～0.826)、0.80(95%CI:0.732～0.854)、0.81(95%CI:0.743～0.863),截断值分别为1.47/U6、23.82pmol/L、5.82ng/mL、10.31ng/mL。以miR-135b、HE4、CEA、CA153截断值作为阳性评判标准,则miR-135b诊断早期NSCLC灵敏度为71.79%,特异度为79.41%,准确度为76.11%。HE4诊断灵敏度为69.23%,特异度为75.49%,准确度为72.78%。CEA诊断灵敏度为74.36%,特异度为71.57%,准确度为72.78%。CA153诊断灵敏度为70.51%,特异度为76.47%,准确度为73.89%,详见图1。

表1各组受试者miR-135b、HE4、CEA、CA153表达水平x¯±s

图1血清miR-135b、HE4、CEA、CA153表达水平诊断早期NSCLC的ROC曲线

2.4血清miR-135b、HE4、CEA、CA153联合检测对早期NSCLC的诊断效能

四者联合检测灵敏度为87.18%,特异度为84.31%,准确度为85.56%,相比于miR-135b单项检测和HE4、CEA、CA153三者联合检测,准确度显著升高(P<0.05),见表3。

3、讨论

全球NSCLC发病率不断升高,虽然医疗水平不断进步,但患者早期诊断率依然很低,导致患者错失最佳治疗时期,致使生存质量差,预后不良[10,11]。因此提高NSCLC诊断率,以提前防治,从而降低NSCLC患者死亡率,探寻NSCLC患者血清肿瘤标志物已迫在眉睫,但是肿瘤血清标志物单独检测往往无法同时兼顾特异性和灵敏度,因而寻求多种肿瘤血清标志物联合检测是临床上提高诊断灵敏度和特异度的重要方法。

miR-135b虽不编码蛋白质,但可特异性与靶标mRNA3'UTR互补配对结合,从而调控机体生理进程,叶岩等[12]研究发现,miR-135b在肺癌组织中高表达,与分化程度、TNM分期、淋巴结转移相关。随后研究发现,miR-135b在前列腺癌患者血清中表达水平明显升高,与临床分期、分化程度呈正相关,提示miR-135b高表达是肿瘤发生的危险因素,可成为诊断和预后标志物[13]。本研究发现,NSCLC患者血清中miR-135b表达水平明显高于健康体检志愿者,与NSCLC患者分期相关,说明miR-135b在早期NSCLC患者血清中高表达,参与NSCLC进程。诊断早期NSCLC曲线下面积为0.78(95%CI:0.710～0.836),截断值为1.47/U6,灵敏度为71.79%,特异度为79.41%,准确度为76.11%,说明miR-135b对早期NSCLC具有一定诊断价值,但是其灵敏度和特异性不高,临床应用受限。

表3血清miR-135b、HE4、CEA、CA153表达水平诊断早期NSCLC的ROC曲线结果

HE4是最新发现的肿瘤标志物,定位于人染色体20q12-13,在肺鳞癌和肺腺癌中高表达[14]。陈波等[15]研究发现,HE4在早期NSCLC患者血清中高表达,与临床分期相关,诊断敏感度为72.41%,特异度为92.63%,准确度为87.90%。CEA最早发现于消化道,可用于诊断和疗效判断[16]。龚红娟等[17]研究发现肺癌血清中CEA表达水平显著高于肺部良性病变和健康对照组,其诊断灵敏度42.06%,特异度72.63%,阳性预测值92.91%,准确度58.06%。CA153常作为肿瘤标志物,有研究发现CA153在早期NSCLC患者血清中高表达,诊断特异度为98.55%,敏感度为53.6%[18]。此外黄丽娟等[19]研究发现HE4、CA125、CEA等联合检测诊断早期卵巢癌敏感度为94.12%,特异度为91.53%,诊断符合率为91.96%,提示联合诊断具有一定的临床应用价值。本研究发现,HE4、CEA、CA153表达水平与患者年龄、性别、病理类型无关,Ⅱ期NSCLC患者表达水平显著高于Ⅰ期患者。说明HE4、CEA、CA153参与NSCLC进程。HE4、CEA、CA153诊断早期NSCLC曲线下面积分别为0.77(95%CI:0.698～0.826)、0.80(95%CI:0.732～0.854)、0.81(95%CI:0.743～0.863),截断值分别为23.82pmol/L、5.82ng/mL、10.31ng/mL,miR-135b联合三者诊断灵敏度为87.18%,特异度为84.31%,准确度为85.56%,相比于miR-135b单项检测和HE4、CEA、CA153三者联合检测,准确度显著升高,说明联合诊断优于单独诊断,具有一定的临床价值。