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NSCLC中IL-33及其受体ST2对Th1Th2Th17型细胞因子的影响

2020-11-16 262 上传者：管理员

摘要：为探究IL-33与受体抑癌蛋白2(suppressionoftumorigenicity2,ST2)及相关细胞因子在非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)患者中的作用,收集30例NSCLC患者样本为病例组,同时收集40例健康者为对照组,采用实时荧光定量PCR法和免疫组化法检测NSCLC组织中IL-33和ST2的mRNA与蛋白水平;ELISA检测样本血清中IL-33/可溶性ST2(solubleST2,sST2)、IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17A的水平;Pearson法分析NSCLC患者血清中IL-33与IL-4、IFN-γ、IL-10、IL-17A的相关性。结果显示,与对照组相比,NSCLC患者病灶组织中IL-33和ST2的mRNA与蛋白水平均显著升高(P<0.05);患者血清中IL-33、sST2、IL-10、IL-17A和IL-4的水平显著升高,IFN-γ水平显著降低(P<0.05);患者血清中IL-33与IL-4、IL-10的水平呈显著正相关(r=0.65,P<0.01;r=0.77,P<0.01),与IFN-γ水平呈显著负相关(r=-0.82,P<0.01),而与IL-17A的水平不相关。由此,IL-33与受体ST2在NSCLC患者中表达增高可能引起Th1/Th2细胞因子分泌的免疫失衡。

关键词：
可溶性抑癌蛋白2
白细胞介素33
细胞因子
肺癌
非小细胞肺癌
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肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,流行病学数据显示,2018年肺癌发病例数占全球肿瘤总病例数的11.6%,占肿瘤总死亡人数的18.4%[1,2]。非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)是最常见的肺癌类型,占肺癌总病例数的(80～90)%,虽然目前治疗方法不断改进,但患者的5年总生存率仍然偏低[3]。因此,深入了解NSCLC的发病机制和探寻新的治疗靶点,寻找新的延长患者生存期的疗法尤为重要。

免疫治疗是近年来靶向治疗研究的一大热点,肿瘤免疫机制研究是很多靶向药物等研发的基础,因此很有必要开展NSCLC发生发展及转移过程中免疫机制作用特点的相关研究[4,5,6]。IL-33作为一种新近发现的促炎细胞因子被认为是组织损伤及机体感染的预警信号之一,在肿瘤的发病机制中扮演着极其重要的角色[7]。抑癌蛋白2(suppressionoftumorigenicity2,ST2)是IL-33的受体,主要表达于肥大细胞、Th2和ILC2表面,有3种亚型,分别为跨膜性ST2、可溶性ST2(solubleST2,sST2)及变异性ST2[8]。已有研究表明,IL-33在乳腺癌[9]、肝癌[10]和肺癌[11]等肿瘤患者中表达增加,其会促进肿瘤的转移和演进,但IL-33/ST2在NSCLC患者中的具体作用机制研究较少。鉴于IL-33与NSCLC患者的关系一直存在争议,且其在NSCLC中的作用机制尚不明了,因此,很有必要开展相关研究,为今后研发高效的NSCLC靶向药物提供一些理论基础。本研究通过检测NSCLC患者IL-33/ST2及相关细胞因子的水平,初步探讨IL-33/ST2在NSCLC发病机制中的作用。

1、材料与方法

1.1 研究对象

收集2017年2月至2019年1月在陕西省核工业二一五医院就诊的30例术前术中均未接受放化疗及免疫治疗且确诊为NSCLC的患者[纳入标准:NSCLC诊疗指南(卫生部2014版)],年龄38～63岁,中位年龄54岁,其中男性24例,女性6例;腺癌10例(其中男性6例,女性4例),鳞癌20例(其中男性18例,女性2例),Ⅰ期患者5例,Ⅱ期患者25例。同时选取40例同期健康体检者为正常对照(其中男性20例,女性20例),两组性别年龄差异均无统计学意义(表1)。所有患者及对照均签署知情同意书,研究经陕西省核工业二一五医院伦理委员会批准。

1.2 试剂与仪器

兔抗人IL-33多克隆抗体和兔抗人ST2多克隆抗体,均购自北京博奥森生物技术有限公司;山羊血清工作液、山羊抗兔IgG-HRP、DAB显色液,均购自北京中杉金桥生物技术有限公司;实时荧光定量PCR试剂盒,购自德国QIAGEN公司;TRIzol试剂,购自Invitrogen公司;反转录试剂盒,购自ThermoFisherScientific公司;IL-33、sST2、IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17AELISA检测试剂盒,购自上海仁捷生物科技有限公司;酶标仪,来自ThermoFisherScientific公司;微量核酸蛋白分析仪,来自德国IMPLEN公司;DFC490图像采集仪、Leica莱卡激光扫描共聚焦显微镜图像处理软件、Image-ProPlus6.0软件,均来自徕卡公司;实时荧光定量PCR仪,来自上海宏石医疗科技有限公司。

1.3 样本的处理

1.3.1 组织样本处理

收集30例NSCLC患者病灶及癌旁组织,生理盐水冲洗,一部分组织用甲醛固定,然后进行石蜡包埋,每例组织样本连续4μm切片,于60℃烤箱烘烤过夜后取出备用,行免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)和HE染色;另一部分组织于-80℃保存,待行荧光定量PCR检测。

1.3.2 全血样本处理

400×g离心两组研究对象的全血样本15min,吸取上清于1.5mLEP管中,-80℃保存,以备后续ELISA检测。

1.4 IHC检测NSCLC患者病灶组织与癌旁组织中IL-33和ST2的表达

脱蜡、水化NSCLC患者病灶组织与癌旁组织石蜡切片,用30mL/LH2O2封闭内源性过氧化物酶15min,再用柠檬酸缓冲液微波修复13min;加入山羊血清封闭液作用30min后弃血清,再加入1∶100稀释的兔抗人IL-33或兔抗人ST2抗体,4℃孵育过夜;样本漂洗后加入山羊抗兔IgG-HRP原液1滴,37℃培养箱孵育25min,再漂洗,加入DAB显色液显色,苏木精复染2min,中性树脂封片。于400倍显微镜视野下每张切片采集10张照片(均在同一光学条件下拍摄),用Image-ProPlus6.0软件分析照片,在HistogramBased(HIS∶H=1～29,I=1～255,S=1～255)模式下辨别阳性显色。

1.5 HE染色观察NSCLC患者病灶组织形态

采用常规HE染色法于光学显微镜下观察NSCLC患者病灶组织形态。

1.6 实时荧光定量PCR法检测NSCLC患者病灶组织与癌旁组织中IL-33与ST2的mRNA水平

从GenBank中检索人IL-33、ST2、β-actin引物序列(表2),通过DNAMAN软件设计引物[引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成]。取出于-80℃保存的NSCLC患者病灶组织,每50～100mg组织加入1mLTRIzol试剂研磨提取总RNA。用微量核酸蛋白分析仪分析RNA浓度和纯度,样本浓度为100～500ng/μL,吸光度值[D(260nm)/D(280nm)]在1.8～2.0之间的样本提示所提取的RNA纯度较高。严格按照反转录试剂盒说明书操作,将RNA反转录为cDNA,用SYBR荧光染料定量检测IL-33和ST2的mRNA表达。反应条件为:预变性(95℃5min),40个循环的扩增反应(95℃变性15s,58℃退火30s,72℃延伸30s)。每个样本均设2个复孔,以β-actin为管家基因,校正每个样本的循环Ct值,结果以2-△△Ct相对定量法评估,计算靶基因的相对表达量。

将IL-33、sST2、IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17A标准品经梯度稀释后调整各浓度至标准曲线,用酶标仪测定吸光度值D(450nm)。空白调零,以标准品为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线。严格按照说明书操作,计算待测血清样本中IL-33、sST2、IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17A的浓度。

1.7 统计学处理

用SPSS21.0统计学软件分析,若符合正态分布,定量资料以x¯±sx¯±s表示,两组间数据比较采用独立样本t检验;若不符合正态分布,则采用Wilcoxon秩和检验,各因素之间相关性分析采用Pearson相关分析,以P<0.05为差异有统计学意义。采用GraphPadPrism5.0软件作图。

2、结果

2.1 IHC与HE染色结果

研究发现,IL-33和ST2在NSCLC患者病灶组织中均有表达。IHC结果显示,IL-33在病灶组织中主要表达于细胞核,且腺癌患者阳性程度较鳞癌高;ST2在样本的细胞核和细胞质中均有表达,以细胞质为主,且鳞癌阳性程度高于腺癌。HE染色法观察患者病灶组织形态,结果显示,鳞癌组织呈片状或巢状,细胞异型性明显,核大深染,易见核分裂象,局灶可见角化珠;腺癌组织呈巢状或条索状,局部可见腺样结构,呈浸润性生长,细胞异型性明显,核大深染,形状不规则。(图1、图2)

图1IL-33和ST2在两组肺组织中的表达(IHC,×400)

图2IL-33和ST2在NSCLC患者病灶组织中的表达(HE&IHC,×400)

2.2 NSCLC患者病灶组织和癌旁组织中IL-33与ST2的mRNA水平

荧光定量PCR检测出NSCLC患者病灶和癌旁组织中IL-33的mRNA相对表达量分别为1.51±0.41、0.97±0.15;病灶和癌旁组织中ST2的mRNA相对表达量分别为0.82±0.17、0.51±0.14。由此,与癌旁组织相比,NSCLC患者病灶组织中IL-33和ST2的mRNA相对表达量均显著增加(图3,P<0.05)。

2.3 NSCLC患者血清中IL-33/sST2及相关细胞因子水平

ELISA检测结果发现,与正常对照组相比,NSCLC患者血清中IL-33、sST2、IL-4、IL-10和IL-17A表达水平显著升高,IFN-γ水平显著降低(表3、图4,P<0.05,P<0.01)。

图3NSCLC患者病灶组织和癌旁组织中IL-33与ST2的mRNA相对表达量

表3NSCLC患者血清中IL-33/sST2、IL-4、IFN-γ、IL-10和IL-17A表达水平

2.4 NSCLC患者血清中IL-33与IL-4、IFN-γ、IL-10、IL-17A的相关性

结果发现,NSCLC患者血清中IL-33与细胞因子IL-4、IL-10的水平呈显著正相关(r=0.65,P<0.01;r=0.77,P<0.01),而与IFN-γ的水平呈显著负相关(r=-0.82,P<0.01),与IL-17A的水平不相关。(图5)

3、讨论

随着国内外学者对IL-33研究的逐渐深入,人们对其在疾病中的作用特点以及与各种肿瘤的联系也有了进一步的了解。Li等[12]在研究结直肠癌时发现,患者体内高表达的IL-33与其受体ST2结合,通过活化NF-κB信号转导通路,上调环氧合酶2(cyclooxygenase2,COX-2)表达,促进前列腺素E2分泌,不利于免疫细胞对肿瘤的及时清除。Wang等[13]在研究骨肉瘤时发现,患者病灶组织中IL-33mRNA和蛋白水平显著高于癌旁组织,由此认为IL-33的表达增高可进一步促进骨肉瘤细胞的转移。Sun等[14]研究表明,IL-33作为一种新型促肿瘤细胞因子,目前已经成为评估肺癌进展的生物标志物,认为其水平升高加速了NSCLC细胞的糖酵解,促进了肿瘤细胞的扩散。本研究通过检测IL-33/ST2在NSCLC患者中的作用特点发现,患者血清中IL-33和sST2水平升高,病灶组织中IL-33/ST2的mRNA和蛋白水平亦增高。作者推测这可能参与了NSCLC的发生发展,促进了肿瘤细胞的扩散和转移。这一结果与Wang等[15]的研究结果相一致,他们认为IL-33具有促肿瘤作用,可促进人NSCLC细胞的生长和转移。

图4NSCLC患者血清中IL-33/sST2、IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17A的水平

图5NSCLC患者血清中IL-33与IL-4、IL-10、IFN-γ、IL-17A的相关性

IL-33属于IL-1家族成员,一般情况下表达于多种细胞的细胞核中,包括DC、巨噬细胞、纤维母细胞、上皮细胞、肥大细胞、内皮细胞以及成骨细胞等。当这些细胞损伤时,IL-33才被释放至细胞核外,通过与其相应配体结合,调节T、B细胞、DC、巨噬细胞、肥大细胞和ILC等的免疫功能,后根据不同细胞类型产生相应的炎症反应[16,17,18]。因此,IL-33水平的升高可作为细胞受损的反馈信号。本研究发现,患者血清中IL-33和sST2的水平均显著升高,但其具体作用目前并不清楚。因此,研究紧接着又通过ELISA检测了IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17A的水平,发现NSCLC患者血清中IL-4、IL-10和IL-17A的水平升高,IFN-γ水平降低;又通过Pearson法分析了NSCLC患者血清中IL-33与IL-4、IFN-γ、IL-10的相关性发现,患者血清中IL-33与IL-4、IL-10的水平呈显著正相关,而与IFN-γ的水平呈显著负相关,推测IL-33的水平增高通过与受体sST2结合,引起Th1型细胞因子(IFN-γ)/Th2型细胞因子(IL-4、IL-10)模式向Th2方向偏移。这不利于宿主产生有效的免疫应答,进一步导致NSCLC细胞发生免疫逃逸。

本研究发现IL-17A在NSCLC患者血清中表达升高,但与IL-33的水平不相关,提示IL-17A可能是标志Ⅰ、Ⅱ期NSCLC患者感染的指标。IL-17A属于IL-17细胞因子家族中的标志性分子,主要由Th17、γδT细胞、NK细胞分泌。已有研究表明,IL-17水平升高在小鼠原位同种异体肿瘤移植模型中会促进前列腺癌的转移[19]。Liu等[20]在研究结直肠癌时发现,IL-17A的水平升高,肿瘤细胞对宿主体内淋巴细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞的侵袭性增强,加重了结直肠癌以直接播散(组织浸润)、血管渗透、淋巴管渗透、浆膜及黏膜面蔓延等方式向周围组织浸润。亦有学者认为,IL-17A是慢性肺病的潜在治疗靶点,其在诱导疾病的发生中发挥主要作用,IL-17A缺乏会降低呼吸道疾病的严重程度[21]。因此,作者推测IL-17A在NSCLC患者血清中水平升高,可能加强了肿瘤细胞对宿主体内免疫细胞的侵袭性,加重了肿瘤细胞对周围组织的浸润性,促进宿主体内发生持续感染,但IL-17A在NSCLC患者体内具体攻击何种免疫细胞将在后续研究中深入展开。

综上所述,本研究结果显示IL-33与其受体ST2在NSCLC患者中水平升高,引起Th1/Th2型细胞因子模式向Th2方向偏移,这不利于免疫细胞对肿瘤细胞的及时清除,进一步促进了NSCLC的免疫逃逸,同时细胞因子IL-17A增加又导致NSCLC患者的炎症反应加强。因此,NSCLC感染过程中引起的免疫病理改变比较复杂,值得根据临床特征和并发症深入研究。

庞盼,赵凯,王博,侯亚文,吴斌艳,吴莉波,高晓,郭瑞林.非小细胞肺癌患者中IL-33及其受体ST2对Th1/Th2/Th17型细胞因子的影响[J].现代免疫学,2020,40(05):379-385.