骨关节炎(osteoarthritis,OA)为多发于中老年人的一种以关节软骨退变和破坏为特征的慢性关节病[1]。关节软骨细胞是关节软骨成分中唯一的细胞单位,其生物学变化与OA的发生、发展密切相关[2]。软骨细胞的作用为维持软骨的完整、负重及修复损伤的软骨[3]。miRNA为由19～25个核苷酸组成的高度保守的短链非编码内源性微小RNA,广泛参与人类的各种疾病[4],包括OA。miR-30a-5p在骨关节组织和关节软骨细胞中均有表达,但其在OA中的作用机制尚不十分清楚。沉默信息调节因子2相关酶Ⅰ(silentinformationregulator1,SIRT1)为Sirtuins家族成员,是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的组蛋白去乙酰化酶,与多种细胞生物学功能密切相关,如细胞周期、细胞衰老、血管生成、能量代谢等[5,6]。刘弼等[7]报道,SIRT1在OA中具有重要作用,但其上游调控机制尚不完全清楚。本研究拟以OA软骨细胞为研究对象,检测miR-30a-5p、SIRT1在OA软骨细胞中的表达,观察抑制miR-30a-5p、过表达SIRT1、抑制SIRT1对OA软骨细胞增殖、凋亡的影响,以揭示其可能的机制,为OA的治疗研究奠定基础。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象

组织标本收集于湖北民族大学附属民大医院2017年3月至2018年10月的OA患者,其中进行全膝人工关节置换术的废弃关节软骨3例,下肢损毁创伤术的废弃髋膝关节软骨2例。本研究经医院医学伦理委员会批准,所有患者及家属均签署了知情同意书。

1.1.2 试剂

DMEM培养液、FCS、MTT、胰蛋白酶均购自Sellect公司;LipofectamineTM2000试剂盒购自上海基星生物公司;二喹啉甲酸(bicinchoninincacid,BCA)蛋白定量试剂盒、RT试剂盒购自大连TaKaRa公司;聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride,PVDF)膜购自罗氏公司;SDS-PAGE试剂盒、增强化学发光(enhancedchemiluminescence,ECL)液和RIPA蛋白裂解液均购自上海碧云天生物技术有限公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司;AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分离培养

参照张庆等[8]的方法分离培养人正常软骨细胞和OA软骨细胞,分别标记为正常对照组和OA组。

1.2.2 细胞转染

将OA软骨细胞随机分为OA+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、OA+anti-miR-30a-5p组(转染anti-miR-30a-5p)、OA+pcDNA组(转染pcDNA)、OA+pcDNA-SIRT1组(转染pcDNA-SIRT1)、OA+anti-miR-30a-5p+si-NC组(anti-miR-30a-5p和si-NC共转染)、OA+anti-miR-30a-5p+si-SIRT1组(anti-miR-30a-5p和si-SIRT1共转染)。按照脂质体LipofectamineTM2000试剂盒说明书要求操作,用4倍DNA或质粒量的脂质体将其转染至OA软骨细胞,转染4h后,更换新鲜培养液继续培养48h,用实时荧光RT-PCR检测转染效率。转染成功后,用于后续实时荧光RT-PCR、Westernblotting、MTT试验、流式细胞术、双荧光素酶报告基因检测试验。

1.2.3 实时荧光RT-PCR

取2mL5×105个/mL的对数生长期各组细胞,严格按照RNA抽提试剂盒说明书要求提取RNA并进行定量检测,然后按照RT试剂盒说明书要求合成cDNA,最后按实时荧光RT-PCR试剂盒说明书要求检测miR-30a-5p。以U6、GAPDH为内参,用2-△△Ct计算miR-30a-5p、SIRT1的表达量。反应条件为:94℃2min,94℃30min,58℃30s,72℃30s,进行45个循环;72℃2min。引物信息(5'→3'):miR-30a-5p上游引物CCAGCCAAAGTAGGAAGGAG,下游引物CCGGAGTTCCTCAGACAAGAG;SIRT1上游引物ACAACCTCCTGTTGGCTGATG,下游引物GCTTGCGTGTGATGCTCTGT。试验重复3次,每次做3个复孔。

1.2.4 Westernblotting

收集5×105个/mL的对数生长期各组细胞,RIPA蛋白裂解液裂解后用BCA法进行定量检测,变性后以16000×g离心2min,取上清液进行蛋白上样。按照Westernblotting常规操作流程进行电泳-转膜-封闭-一抗孵育-二抗孵育-显影曝光。ImageJ软件分析目的条带的灰度值,以目的条带灰度值与β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的表达。所用一抗为兔抗人多克隆SIRT1抗体(1∶1000),二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体(1∶15000)。试验重复3次,每次做3个复孔。

1.2.5 MTT试验

取100μL5×105个/mL各组细胞,加入20μL5g/L的MTT溶液,培养4h,然后弃去上清液,每孔加入150μL二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO),震荡,使结晶溶解,检测细胞光密度[D(490nm)]。细胞的增殖力与D呈正比。试验重复3次,每次做3个复孔。

1.2.6 流式细胞术

收集5mL5×105个/mL各转染组细胞,离心后用结合缓冲液500μL悬浮细胞,分别加入5μL的AnnexinV-FITC和PI,混匀,室温避光静置15min。采用FCM进行测定。细胞的凋亡率(%)=早期凋亡率(%)+晚期凋亡率(%)。试验重复3次,每次做3个复孔。

1.2.7 双荧光素酶报告基因检测试验

取5mL5×105个/mL的对数生长期各组细胞,将质粒SIRT1-3'UTRWT和SIRT1-3'UTRMUT用psiCHECK2进行连接,然后将其插入OA软骨细胞。再用脂质体法将其分别与miR-NC、miR-30a-5p共转染,最后按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书要求进行操作,以psiCHECK2-SIRT1-3'UTRWT和psiCHECK2-SIRT1-3'UTRMUT的表达为对照,观察miR-30a-5p对SIRT1表达的影响。试验重复3次,每次做3个复孔。

1.3 统计学处理

采用SPSS21.0软件进行统计分析,计量资料用x¯±sx¯±s表示,多组间数据比较采用单因素方差分析,两两比较采用q检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 miR-30a-5p和SIRT1在人原代OA软骨细胞及正常软骨细胞中的表达

与正常对照组比较,OA组软骨细胞中miR-30a-5p的表达显著升高(P<0.05),SIRT1mRNA的表达显著降低(P<0.05),SIRT1蛋白的表达显著降低(P<0.05)。(图1)

图1miR-30a-5p和SIRT1在人原代OA软骨细胞及正常软骨细胞中的表达

2.2 抑制miR-30a-5p表达对人OA软骨细胞增殖的影响

与正常对照组比较,OA+anti-miR-NC组软骨细胞中miR-30a-5p的表达量显著升高(P<0.05),细胞活性显著降低(P<0.05)。与OA+anti-miR-NC组比较,OA+anti-miR-30a-5p组软骨细胞中miR-30a-5p的表达量显著降低(P<0.05),细胞活性显著升高(P<0.05)。(图2)

图2抑制miR-30a-5p表达对人OA软骨细胞增殖的影响

2.3 抑制miR-30a-5p表达对人OA软骨细胞凋亡的影响

与正常对照组比较,OA+anti-miR-NC组软骨细胞的凋亡率显著升高(P<0.05)。与OA+anti-miR-NC组比较,OA+anti-miR-30a-5p组软骨细胞的凋亡率显著降低(P<0.05)。(图3)

图3抑制miR-30a-5p表达对人OA软骨细胞凋亡的影响

2.4 过表达SIRT1对人OA软骨细胞增殖和凋亡的影响

与正常对照组比较,OA+pcDNA组软骨细胞中SIRT1表达显著降低(P<0.05),细胞活性显著降低(P<0.05),细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。与OA+pcDNA组比较,OA+pcDNA-SIRT1组软骨细胞中SIRT1表达显著升高(P<0.05),细胞活性显著升高(P<0.05),细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。(图4)

图4过表达SIRT1对人OA软骨细胞增殖和凋亡的影响

2.5 miR-30a-5p靶向SIRT1

运用miRcode数据库预测到miR-30a-5p与SIRT1-3'UTR存在结合位点。双荧光素酶活性检测结果显示,与miR-NC组比较,miR-30a-5p组WT-SIRT1细胞中荧光活性显著降低(P<0.05),MUT-SIRT1细胞中荧光活性不受影响(P>0.05)。与miR-NC组比较,miR-30a-5p组细胞中SIRT1表达显著降低(P<0.05)。与anti-miR-NC组比较,anti-miR-30a-5p组细胞中SIRT1表达显著升高(P<0.05)。(图5)

图5miR-30a-5p靶向SIRT1

2.6 抑制SIRT1的表达逆转了抑制miR-30a-5p表达对人OA软骨细胞的增殖促进和凋亡抑制作用

与OA+anti-miR-NC组比较,OA+anti-miR-30a-5p组细胞活性显著升高(P<0.05),细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。与OA+anti-miR-30a-5p+si-NC组比较,OA+anti-miR-30a-5p+si-SIRT1组细胞活性显著降低(P<0.05),细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。(图6)

图6抑制SIRT1的表达逆转了抑制miR-30a-5p表达对人OA软骨细胞的增殖促进和凋亡抑制作用

3、讨论

miRNA是一种微小RNA分子,通过与靶mRNA结合发挥基因沉默和翻译抑制的作用[9]。自1993年发现miRNA以来,其在整个物种的所有真核细胞中均被发现[10]。近年来,miRNA因在视网膜疾病、神经退行性疾病、心血管疾病、肿瘤等多种人类疾病的发生、发展中具有调控作用而被广泛研究,尤其是骨关节软骨疾病[11]。miR-30a-5p在胰腺炎、脊髓损伤、骨肉瘤中均具有关键的作用[12,13,14]。夏泽楠[15]在研究OA的miRNA表达谱中运用芯片检测发现,miR-30a为表达明显上调的miRNA中的一员。沈鹏飞等[16]在软骨细胞的研究中发现,OA患者软骨组织中miR-30a-5p的表达显著升高,蛋白激酶B(proteinkinaseB,AKT)基因表达显著下调,且miR-30a-5p的表达与AKT呈负相关,与细胞凋亡率呈正相关;另外,在SW1353细胞中miR-30a-5p靶向AKT基因,且过表达miR-30a-5p可促进细胞凋亡,阻滞G0/G1期,揭示了miR-30a-5p在OA患者软骨组织中高表达,且通过靶向AKT诱导软骨细胞凋亡的结论。本研究运用实时荧光RT-PCR检测了人原代OA软骨细胞中miR-30a-5p的表达,发现miR-30a-5p高表达,抑制miR-30a-5p可促进软骨细胞增殖,抑制其凋亡,这与沈鹏飞的研究结果相一致。进一步运用双荧光素酶报告基因检测试验验证,miR-30a-5p靶向SIRT1。

人脂联素(humanadiponectin,ADT)依赖的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶由SirT1-7组成,其中SIRT1已被广泛研究,且在调节细胞分化、增殖、存活和机体生长方面发挥关键作用[17,18]。SIRT1抑制细胞凋亡并促进各种类型细胞的存活。有研究发现,SIRT1在关节炎患者软骨细胞中的表达异常降低,在软骨细胞抗衰老凋亡中起重要作用[19]。Dvir-Ginzberg等[20]研究发现,SIRT1的表达与软骨特异性基因的表达呈正相关,且SIRT1、烟酰胺磷酸化核糖转移酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadeninedinucleotide,NAD)可能通过上调软骨细胞外基质编码基因的表达,在人类软骨中发挥积极作用。胡斌等[21]研究发现,SIRT1存在于人软骨细胞及软骨组织中,且可促进软骨细胞增殖,抑制其凋亡,提高细胞抗应激能力。Takayama等[22]在软骨细胞的研究中发现,在人软骨细胞和人软骨样品中均有SIRT1表达,沉默SIRT1可以促进软骨细胞凋亡,上调裂解的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[cleavedpoly(adenosinediphosphateribose)polymerase,CleavedPARP]、裂解的半胱氨酸蛋白酶3(CleavedCaspases-3)和裂解的半胱氨酸蛋白酶9(CleavedCaspases-9),用白藜芦醇处理可降低软骨细胞的凋亡率,下调CleavedPARP、CleavedCaspases-3和CleavedCaspases-9,且沉默SIRT1减少了B淋巴细胞瘤2基因(B-celllymphoma2,Bcl-2)的量,增加了Bcl-2相关蛋白(Bcl-2associatedXprotein,Bax)的量,而白藜芦醇减少了Bcl-2的量但增加了Bax的量,表明SIRT1通过调节线粒体相关的凋亡信号调节人软骨细胞的凋亡。本研究运用实时荧光RT-PCR检测了人原代OA软骨细胞中SIRT1的表达,发现SIRT1低表达,且过表达SIRT1可促进软骨细胞增殖,抑制其凋亡。进一步研究发现,抑制SIRT1逆转了抑制miR-30a-5p对人OA软骨细胞的增殖促进和凋亡抑制作用。

综上所述,miR-30a-5p可抑制人软骨细胞的增殖,促进其凋亡,机制可能与靶向负调控SIRT1有关,这为OA的治疗提供了新方向。

参考文献：

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[4]宿宁,田猛,罗玉梅,等.微RNA在心力衰竭病理生理进程中的研究进展[J].医学综述,2018,24(1):46-50.

[7]刘弼,雷鸣,肖德明.抗衰老基因SIRT1对骨关节炎的防治影响[J].中国矫形外科杂志,2012,20(15):1402-1404.

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[10]魏建春,安静.微小RNA在病毒与宿主相互作用中的功能[J].微生物与感染,2017,12(1):57-64.

[15]夏泽楠.骨关节炎关节软骨祖细胞功能活性及miRNA表达谱的改变[D].北京:北京协和医学院,2014.

[16]沈鹏飞,瞿玉兴,王斌,等.miR-30a-5p靶向作用蛋白激酶B基因促进骨关节炎患者软骨细胞的凋亡[J].中华医学杂志,2017,97(39):3079-3084.

[21]胡斌,徐宏光,宋俊兴.沉默信息调节因子2同源蛋白1与软骨细胞[J].国际骨科学杂志,2012,33(4):237-239.

刘清高,陈文革.miR-30a-5p靶向SIRT1调控骨关节炎软骨细胞增殖和凋亡的研究[J].现代免疫学,2020,40(05):372-378.