肺癌是世界上最常见恶性肿瘤之一[1],近年来肺癌中腺癌分型发病率高于鳞状细胞癌,且5年生存率较低[2,3]。尽管目前治疗肺癌方法较多,并且取得一定的进展,但临床研究数据表明[4],很多肺腺癌患者在确诊时往往处于癌症中末期,失去手术治疗的机会。当然,放射治疗(放疗)和化学治疗(化疗)等治疗手段也常用于该肿瘤的治疗,但这些手段副作用大,且对于大多中晚期患者效果甚微[5]。因此,迫切需要寻求新的治疗方法和药物。据研究[6],铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)含有多种活性成分,具有保肝、抗疲劳、降糖以及护胃等作用[7],具有很高的药用价值。更有研究表明,铁皮石斛对乳腺癌[8]、消化道恶性肿瘤[6,7]、肺癌等多种恶性肿瘤有预防和抑制作用。临床研究发现[9],连续食用鲜铁皮石斛可提高中晚期非小细胞肺癌患者化疗后整体生活质量,并明显延长患者无进展生存期。通过前期实验研究结果证明[10],综合抑瘤率、移植瘤组织坏死情况以及移植瘤生长曲线初步得出铁皮石斛可以通过促进肿瘤细胞及其组织的坏死,达到抑制移植瘤体积生长的目的;其中高浓度铁皮石斛用药组药效更加稳定。而铁皮石斛作用机制有待进一步的探究和分析。在肺癌发展过程中往往伴有相关基因表达的改变,因此,笔者在本实验建立肺腺癌裸鼠移植瘤模型,进一步分析中药鲜铁皮石斛对肺腺癌移植瘤的抑制情况及其相关机制。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

无特定病原体(SPF)级BLB/c裸鼠30只,雄雌各半,3～5周龄,体质量(16±2)g,购于湖南斯莱克景达实验动物有限责任公司,实验动物生产许可证号:SCXK(湘)2016-0002。自由饮水和摄食,动物房恒温22℃,相对湿度60%。

1.1.2仪器

5410型低温高速离心机(德国Eppendorf公司);BSC-1300ⅡB2型生物安全柜(上海博讯医疗生物仪器股份有限公司);二氧化碳(CO2)培养箱(ThermoForma公司),7500Fast型实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)系统(美国AppliedBiosystems公司)。倒置显微镜(日本Olympus公司),电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司,感量:0.01mg]。

1.1.3药材

鲜铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo),来源于广西上林县,新鲜铁皮石斛切碎加纯水,料理机制得铁皮石斛浆,离心除渣,浓缩灭菌,4℃保存备用(每毫升相当于鲜药材0.68g)。本药品由广西中医药大学第一附属医院药学部制剂中心制得,并由广西中医药大学第一附属医院药学部黄敏主任中药师鉴定为正品。

1.1.4药品与试剂

环磷酰胺(百特医疗用品贸易有限公司,批号:8F246A),胎牛血清(FBS,南美Lonsa公司)、鼠抗人ki67单克隆抗体及免疫组化(SP法)试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司,批号分别为1907170672h、190704S407b。Beclin1单克隆抗体(美国Abcam公司,批号:GR3204186-2)。RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒均购于天根生化科技(北京)有限公司,批号分别为RN05004M、FP205-02。

1.1.5细胞

人肺腺癌A549细胞购自中科院细胞库,后由实验室接种并保存。

1.2A549肺腺癌细胞培养

生物安全柜紫外照射30min后,将肺腺癌A549细胞置于含有配好达尔伯克改良伊格尔培养基(dulbecco'smodifiedeagle'smedium,DMEM)中(FBS、青霉素-链霉素溶液和DMEM高糖比例10:1:90),在37℃二氧化碳培养箱中培养,并保存A549细胞,每天润洗换液。当细胞生长达到临界值(约80%覆盖率)时,收集细胞并传代。

1.3A549肺腺癌细胞收集

在细胞生长的对数阶段,细胞处于良好状态。在细胞中加入胰酶进行消化,离心处理后,加入磷酸盐缓冲液(PBS)。再次离心后,加入供种植移植瘤所需要PBS(每只裸鼠种植0.1mL,含细胞1×107个)。

1.4动物分组及造模

裸鼠适应约1周,取30只。随机取5只,作为空白对照组,25只进行肿瘤模型的建立。腹腔注射戊巴比妥0.1mL·(10g)-1。取肺腺癌A549单细胞悬液,皮下注射至裸鼠右侧背部0.1mL。7d后出现肿瘤,观察裸鼠成瘤情况。25只裸鼠在细胞接种后7d成瘤,第10天肿瘤达到90～110mm3。造模大鼠再随机分为5组,模型对照组,环磷酰胺组,铁皮石斛小、中、大剂量组,每组5只。

1.5动物给药方法

环磷酰胺组腹腔注射环磷酰胺0.025g·kg-1,每隔1天给药,共13次;铁皮石斛小、中、大剂量组分别灌胃给予0.68g·mL-1铁皮石斛6.25,12.50,25.00g·kg-1,连续25d。空白对照组和模型对照组灌胃0.9%氯化钠溶液,每天30mL·kg-1,连续25d。

1.6裸鼠移植瘤体生长情况以及取材

每天在固定时间段内观察被接种细胞裸鼠的活动、精神、饮食、瘤体生长情况。每3天测定小鼠肿瘤体积(肿瘤体积=长×宽2×0.5)及体质量,4周后处死动物。取移植瘤时,冰上操作,用无酶镊子和眼科剪剥离出完整的移植瘤,快速将周围脂肪和坏死组织,以及包膜、血水去除,用眼科剪剪成两块,其中一块迅速放入RNA保存液中,置于冰上,经梯度冻存(4℃20min,-20℃50min,-80℃)待用。另一块置于10%甲醛溶液中固定保存待用。

1.7免疫组化方法检测瘤体Beclin1、Ki67的表达

常规石蜡包埋及切片(厚度4μm);取一定量pH值6.0柠檬酸盐缓冲液,加入微波炉中,脱蜡、水化;封闭后,分别加一抗Beclin1(1:80)、Ki67,4℃过夜,加二抗37℃孵育30min(MaxVision-HRP鼠/兔二抗),DAB显色,苏木精复染,脱水,透明,封片。评判标准:由两位病理科主治及以上医师独立进行阅片。

根据5个400倍随机视野内Beclin1染色强度和阳性细胞比例判定。Beclin1显示胞质阳性。染色强度分别是不着色、淡黄色、棕黄色、黄褐色,分别对应0分、1分、2分、3分。阳性细胞(胞质有黄色或黄棕褐色颗粒)<5%、5%～25%、>25%～50%、>50%～75%、>75%分别对应0,1,2,3,4分。

表达强度=染色强度X阳性细胞,阴性(-)、弱阳性(+)、中阳性(++)、强阳性(+++)分别对应总分0分、1～4分、5～8分、9～12分;“-”为不表达,“+”为低表达,“++”及以上为高表达[11]。

Ki-67的阳性表达根据细胞着色的强度和阳性细胞数综合判定结果,其阳性表达判断标准为:染色强度分别是不着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色,分别对应0分、1分、2分、3分,于高倍镜下(×400)计算每张切片阳性细胞百分率,根据阳性细胞所占百分比打分:<5%判为0分,5%～<25%判为1分,25%～<50%判为2分,≥50%判为3分,并以每个组织着色程度及染色细胞百分率得分相加的和为最后得分:0～1分为阴性(-),2分为弱阳性(+),3～4分为阳性(++),5～6分为强阳性(+++)[12]。

1.8RT-PCR方法

检测瘤体表皮生长因子(EGFR)、p53、p16mRNA表达取瘤体组织50mg,提取总RNA后,用AvianMyeloblastosisVirus逆转录酶(AMV)进行逆转录,以β-actin作为内参,检测EGFR、p53和p16mRNA的表达。建立RT-PCR反应体系:2×SuperRealPreMixPlus10μL,β-actin的上、下游引物各0.6μL,EGFR,p53和p16上、下游引物各0.6μL,RNase-freeddH2O加至20μL。PCR反应条件为:95℃,15min;95℃,10s;60℃,32s。计算2-△△CT,得出数据以模型对照组数值为1,比较环磷酰胺组及铁皮石斛小,中,大剂量组表达量,与模型对照组比较,数值>1则为上调,数值<1则为下调。引物序列见表1。

表1RT-PCR引物序列

1.9统计学方法

采用SPSS25.0统计分析软件进行分析,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,两组间均数比较采用t检验;计数资料采用率表示,采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1用药裸鼠状态比较

铁皮石斛给药前,各组裸鼠生长情况和精神状态正常。灌胃给药后,与空白对照组比较,铁皮石斛小、中、大剂量组裸鼠精神、活动、食欲差异无统计学意义。与模型对照组比较,铁皮石斛小、中、大剂量组肺腺癌移植瘤生长较慢,环磷酰胺组移植瘤同样生长缓于模型对照组,但与空白对照组比较,环磷酰胺组裸鼠出现活力降低、精神萎靡。

2.2肿瘤移植瘤瘤体体积变化情况

前期研究表明[10],不同浓度铁皮石斛均对肺腺癌移植瘤有一定的抑制作用。环磷酰胺组和铁皮石斛小、中、大剂量组抑瘤率分别达到62.0%,51.0%,52.0%,56.0%,呈现剂量依赖关系。与模型对照组比较,铁皮石斛小、中、大剂量组肿瘤体积生长缓慢,且抑瘤率高。其中铁皮石斛大剂量组瘤体(平均0.9cm)较模型对照组(平均1.8cm)明显缩小,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2移植瘤形态学改变情况

2.2.1肉眼观察移植瘤大体

早期裸鼠移植瘤瘤体光滑,多为圆形或椭圆球状,随着时间推移,裸鼠移植瘤瘤体形状开始出现不规则现象,个别移植瘤瘤体表面会出现凹凸不平。模型对照组由于瘤体体积大,瘤体表面会有破溃出现。剥离的移植瘤与皮下组织分界清楚,少有浸润性粘连现象,移植瘤瘤体肉眼观见大部分呈现淡红色,多数呈圆球状或椭圆球状,瘤体质地坚硬,切开横断面组织呈苍白色,可见血管。

2.2.2移植瘤组织坏死情况

前期研究结果显示[10],模型对照组可见肺腺癌腺体,癌细胞排列紧密且均匀,癌细胞核仁体积大,出现核分叶,双核,巨核以及核分裂象增多,有细胞核浆比例失调的现象,失去正常的细胞形态。移植瘤组织癌细胞坏死面积较少。环磷酰胺组和铁皮石斛小、中、大剂量组移植瘤组织癌细胞均有不同程度坏死,癌细胞相比于模型对照组数目少,癌细胞完整性差,细胞坏死部分有核溶解,核固缩和碎裂等现象。与模型对照组比较,铁皮石斛小,中,大剂量组移植瘤组织细胞坏死面积显著升高。组间进行比较,铁皮石斛大剂量组和环磷酰胺组坏死面积多个视野达到一半以上,铁皮石斛中,小剂量组同样可见移植瘤组织细胞坏死。见图1。

2.3Beclin1蛋白表达情况观察

结果显示,自噬基因Beclin1蛋白在模型对照组中低表达。铁皮石斛干预后,与模型对照组比较,铁皮石斛中剂量组和大剂量组、环磷酰胺组Beclin1阳性高表达率逐渐升高,且呈剂量依赖性特点,其中环磷酰胺组差异有统计学意义(χ2=4.412,P<0.05),见图2,表2。

2.4Ki67免疫组化表达情况观察

结果显示,增殖指数Ki67蛋白在模型对照组中呈现高表达,经铁皮石斛干预用药后,与模型对照组比较,铁皮石斛大剂量组以及环磷酰胺组的增殖指数Ki67阳性率逐渐降低,且呈剂量依赖性特点,其中环磷酰胺组的差异有统计学意义(χ2=4.412,P<0.05),见图3,表2。

2.5EGFR、p16、p53mRNA表达

结果见表3。RT-PCR实验结果显示,与模型对照组比较,铁皮石斛大剂量和中剂量组裸鼠移植瘤组织中EGFRmRNA水平均显示下调。其中,铁皮石斛大剂量差异有统计学意义(P<0.05),铁皮石斛中剂量和小剂量组差异无统计学意义(均P>0.05)。与模型对照组比较,铁皮石斛大,中,小剂量组裸鼠移植瘤组织中p53和p16mRNA水平均显示上调。其中,铁皮石斛大剂量和中剂量组裸鼠移植瘤组织中p16mRNA差异有统计学意义(均P<0.05),铁皮石斛小剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。与模型对照组比较,铁皮石斛大,中,小剂量组裸鼠移植瘤组织中的p53mRNA均差异有统计学意义(均P<0.05),见表3。

图15组肺腺癌裸鼠肿瘤组织形态学改变(HE,×200)

图25组裸鼠移植瘤组织中Beclin1的表达(×200)

图35组裸鼠组织中Ki67的表达(×200)

表25组裸鼠移植瘤Beclin1和Ki67蛋白表达的阳性率比较

表35组裸鼠肿瘤组织中EGFR、p16、p53mRNA表达

3、讨论

我国肺癌发病率也在不断上升,且肿瘤细胞侵袭和转移导致患者病死率越来越高[13,14]。寻找更为有效的治疗方法和缓解药物是当前临床医学和药学领域研究的热点。铁皮石斛证明有抗癌的效用[15],但其抑制肺癌的作用机制尚不明确。有临床试验研究发现,经铁皮石斛治疗患者实体瘤疗效总有效率要优于使用临床常规化疗方案组,且患者因化疗导致的毒副作用得到缓解。这提示铁皮石斛可提高中晚期非小细胞肺癌患者化疗后的整体生活质量,并明显延长患者无进展生存期。

本实验所采用的BALB/c品系裸鼠由于缺少免疫器官免疫力低下,对异种人肺腺癌细胞无排斥反应。种植后肺腺癌细胞移植瘤组织形态良好,根据《现代肿瘤治疗药物学》关于抗肿瘤中药有效的标准,抑瘤率>30%则代表抑制肿瘤有效,根据笔者前期实验证实,铁皮石斛对A549细胞裸鼠移植瘤的生长具有抑制作用。此外,经铁皮石斛干预的移植瘤组织癌细胞均有不同程度坏死,高剂量铁皮石斛用药组坏死面积多个视野达到一半以上[10]。

EGFR参与多种实体肿瘤疾病进展过程,EGFR的下调使非小细胞肺癌细胞增殖活力以及侵袭能力降低[16]。此外,与EGFR相关通路磷酸化激活的抑制可以抑制肿瘤细胞增殖,抑制肿瘤血管生成,降低肿瘤细胞的侵袭能力[17]。本实验过程结果显示,与模型对照组比较,铁皮石斛大剂量和中剂量组裸鼠移植瘤组织中EGFRmRNA水平均显示下调。其中,环磷酰胺组和铁皮石斛大剂量组差异有统计学意义(P<0.05)。根据前述研究,提示铁皮石斛可通过下调EGFRmRNA的表达达到抑制肺腺癌移植瘤生长,同时推测其抑制肺腺癌的作用机制可能通过与抑制EGFR相关通路激活有关。

自噬在促进非小细胞肺癌细胞凋亡中起到积极作用,抑制自噬意味限制细胞克服压力和维持体内平衡的能力。在肾部肿瘤组织中,自噬相关基因Beclin1表达低于正常组织,而Beclin1的低表达肿瘤患者预后比Beclin1高表达的肿瘤患者差[18]。同样,Beclin1对非小细胞肺癌有抑癌作用,低表达的Beclin1导致肺癌中的自噬体形成减少,肿瘤细胞的自噬能力降低,异常的肿瘤细胞凋亡减少且有持续增加的趋势,最终导致肺癌的发生发展[19]。Beclin1通过诱导自噬的发生抑制肺癌,且Beclin1阳性表达水平和肿瘤体积、TNM分期呈负相关,同分化程度呈正相关[20]。这与本实验免疫组化结果中Beclin1在模型对照组高表达一致。此外,在肺腺癌进展过程中,发现Beclin1基因表达呈下降趋势,而Beclin1低表达会抑制癌细胞的自噬功能,癌细胞的凋亡受到抑制,导致癌细胞的恶性增殖,促进肺腺癌的发生发展。而本实验免疫组化结果显示,铁皮石斛大,中剂量组以及环磷酰胺组肺腺癌移植瘤中Beclin1阳性表达率较模型对照组升高,分析铁皮石斛可能通过上调自噬相关基因Beclin1的表达,促进细胞自噬,最后抑制肺腺癌肿瘤细胞的恶性增殖。另有研究者表明,Beclin1是维持肺腺癌发生发展的关键组成部分,它可以通过介导自噬机制抑制肿瘤发生,其异常表达常会破坏自噬和凋亡通路[21]。由此可见,自噬基因Beclin1的表达与肺腺癌的发生发展密切相关,在一定条件下可诱导癌细胞凋亡。另有研究表明,p53和Beclin1可以通过Beclin1-p53相互作用,研究者提出[22],BECN1+/-细胞中Beclin1水平的降低可能通过促进Bcl-2的活性,从而增加细胞存活,促进肿瘤的发生。其中Bcl-2的凋亡相关Bax蛋白是p53下游的应答蛋白,协同参与细胞凋亡调节过程。Beclin1的减少会导致p53水平低下,可能导致DNA的损伤以及促进基因组的不稳定性,最后导致肿瘤发生。本实验结果显示,铁皮石斛给药组裸鼠移植瘤组织中p53mRNA水平均显示上调,差异有统计学意义(P<0.05),提示铁皮石斛抑制A549肺腺癌细胞的作用机制可能通过上调肿瘤自噬相关基因Beclin1和抑癌基因p53有关,过表达Beclin1会上调p53,提示可能通过Beclin1-p53途经相互作用,修复基因不稳定性,抑制肿瘤发生。

p16是检测肿瘤常用指标,同时也是最受关注的抑癌基因之一[23],其作为一种肿瘤抑制剂,可以阻止细胞周期的进展和增殖,参与诱导细胞周期阻滞[24]。在过表达p16的转基因小鼠中,细胞增殖显著减少,组织再生相应减少[25]。有研究发现[26],p16基因的突变是小鼠恶性肿瘤发生转移的驱动因素,它参与并调控细胞周期,达到抑制肿瘤细胞异常增殖的目的[27],对肿瘤细胞起到负性调节作用[28]。高越等[29]研究发现,在p16低表达的非小细胞癌患者更容易发生淋巴结转移,越是晚期的患者p16蛋白的缺失情况越明显。本实验中各剂量铁皮石斛给药组裸鼠移植瘤组织中的p16mRNA水平上调,铁皮石斛中,大剂量组裸鼠移植瘤组织中p16mRNA差异有统计学意义(P<0.05)。武世伍等[30]对非小细胞肺癌中p16和Ki67进行了相关性分析,研究发现癌组织中Ki67的表达水平同p16表达率呈负相关关系。这提示p16和Ki67和非小细胞肺癌的增殖发生相关,且抑癌基因p16可能与增殖指数Ki67协同作用。其中增殖因子Ki67是细胞增殖的标志,对肿瘤的发生、发展和判断肿瘤细胞活性有着重要意义。Ki67阳性预示着肺癌细胞增殖活跃,病情容易进展。本实验结果显示,Ki67蛋白经铁皮石斛干预后,与模型对照组比较,铁皮石斛大剂量组、环磷酰胺组Ki67阳性率降低。各剂量铁皮石斛给药组裸鼠移植瘤组织中p16mRNA水平显示上调。其中,铁皮石斛大剂量组和中剂量组裸鼠移植瘤组织中p16mRNA差异有统计学意义(P<0.05)。据如上文献以及本实验结果所述,提示铁皮石斛抑制A549肺腺癌细胞的作用机制可能与上调抑癌基因p16和抑制癌增殖因子Ki67有关,可能通过p16和Ki67之间的负调控关系相互制约维持平衡,最后达到抑制肺腺癌发生发展的目的。

综上所述,铁皮石斛抑制肺腺癌裸鼠移植瘤组织的作用机制可能与自噬相关因子Beclin1相关,通过Beclin1-p53和p16-Ki67相互协同作用以及调控与肿瘤血管生成相关因子EGFR表达量实现抑制移植瘤组织生长的目的,可能通过启动细胞自噬从而诱导细胞凋亡。

参考文献：

[3]刘清华,李振华,李定彪.非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药机制及其与微小RNAs关系的研究进展[J].实用心脑肺血管病杂志,2019,27(2):9-14,19.

[4]闫秀萍,罗虎,周向东.人肺癌细胞系A549中肿瘤干细胞样细胞的分离及鉴定[J].第三军医大学学报,2012,34(12):1153-1157.

[5]莫安薇,麦泽锋,王燕艳,等.康莱特注射液联合洛铂治疗非小细胞肺癌恶性胸腔积液的临床研究[J].现代药物与临床,2019,34(4):1080-1083.

[6]王高玉,刘红宁,戈淑超,等.铁皮石斛水提物对胃癌前病变作用的尿液代谢组学分析[J].中国实验方剂学杂志,2018,24(21):77-85.

[7]赵益,刘燕,蓝希明,等.铁皮石斛提取物对胃癌癌变的抑制作用及机制研究[J].中草药,2015,46(24):3704-3709.

[11]刘永波,陈奕至,郭怡辉,等.Atg3和Beclin1表达在乳腺癌新辅助化疗疗效预测中的价值[J].现代仪器与医疗,2018,24(3):63-65.

[12]胡华平.Survivin和Ki-67在肾细胞癌中的表达及其临床意义[D].福州:福建医科大学,2013:1-14.

[13]张宁,卢创新,务森,等.miR-138-5p在非小细胞肺癌中的表达及临床意义[J].临床肿瘤学杂志,2019,24(2):149-152.

[14]林云,李宁,李艳,等.淫羊藿素对人肺癌A549细胞存活､迁移和侵袭能力的影响及作用机制研究[J].癌症进展,2019,17(15):1763-1765,1770.

庞晨,张锡流,张秀玲,叶星江,黄敏.鲜铁皮石斛对肺腺癌裸鼠移植瘤中自噬及抑癌基因表达的影响[J].医药导报,2021,40(02):163-169.