肺癌细胞主要起源于支气管的黏膜上皮细胞病变。肺癌患者早期无特异性特征，主要原因是肺泡无感觉神经，无法感知到疼痛，随着病情的发展，患者会产生咳嗽、咳血、胸痛等症状。诱导肺癌产生的常见因素有吸烟、工作或生活环境中接触石棉、砷等有害物质、家族史等。过氧化氢(H2O2)是氧化还原代谢过程中的产物，在正常的生理状态下，H2O2水平是细胞通过活性氧(ROS)生成及清除的平衡系统进行调控，当发生病理变化时，H2O2水平脱离细胞控制，H2O2水平发生紊乱，胞内核酸、蛋白质结构及功能单位受损，甚至导致细胞凋亡，引发癌症及严重并发症，故人体细胞正常的生理代谢离不开平衡的H2O2水平[1]。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶C(PKC)具有调控细胞增殖及凋亡的作用。PKC多分布于哺乳动物的器官、组织和细胞中，是细胞质内的脂质依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，依赖磷脂散发活性，可以被Ca2+激活，在细胞内进行信号传导，维持细胞的生长代谢、细胞分裂、增殖及凋亡，重塑细胞骨架蛋白，具有调节离子通道及细胞分泌的作用[2]。由于肺癌患者早期无特异性症状，导致其发现时多为中晚期，常见的治疗方法为放、化疗法，其中选择放疗的患者居半数以上，但因放疗进程较长，患者治疗依从性大大降低，影响预后。近年来发现[3],中医对于肺癌的治疗具有一定的作用，且无副作用。姜黄素具有抗炎、抗氧化等作用，已有学者证实，姜黄素在乳腺癌[4]、胃癌[5]、肺癌[6]等中具有抗癌作用，但其对于肺癌治疗的具体机制尚未完全掌握。本研究探讨姜黄素对肺癌细胞外源性H2O2氧化应激及PI3K/PKC通路的作用机制。

1、材料和方法

1.1 细胞来源

肺癌细胞A549来自上海和序生物科技有限公司。

1.2 实验试剂、仪器与药物

姜黄素(深圳乐芙生物公司，纯度99%);H2O2试剂盒(武汉伊莱瑞特生物公司);噻唑蓝(MTT)溶液(上海尚宝生物公司);流式细胞仪(北京焕彩元合科技公司，型号：BD FACSCelesta);超氧化物岐酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒(合肥莱尔生物公司);PI3K、p-PI3K、PKC、p-PKC一抗(深圳子科生物公司);辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗(西安沐森生物公司)。

1.3 姜黄素配制

姜黄素用二甲基亚砜(DMSO)溶解配成220 μmol/L母液，-20 ℃保存，实验前用RPMI1640 培养基分别稀释配成所需浓度[7]。

1.4 细胞培养与分组

培养：将A549细胞接种于6孔板中培养，RPMI1640培养液中含链霉素及10%胎牛血清，常规培养，待细胞融合至80%时，传代，2～3代备用。肺癌组：肺癌细胞常规培养，不加入姜黄素；姜黄素低组：在含有肺癌细胞培养液的培养基中加入40 μmol/L姜黄素；姜黄素中组：在含有肺癌细胞培养液的培养基中加入80 μmol/L姜黄素；姜黄素高组：在含有肺癌细胞培养液的培养基中加入160 μmol/L姜黄素。

1.5 检测指标

1.5.1 MTT检测细胞增殖

取各组肺癌细胞，在96孔板中进行接种，每组复孔数量选择5个，向每孔(细胞数8×103个)加入100 μl完全培养基，进行3次重复试验。于24、48、72 h分别加入20 μl(5 g/L)MTT,静止6 h后，向每孔加入150 μl十二烷基硫酸钠(SDS,10%,mol/L),37 ℃培养箱中避光过夜孵育，取出96孔板，用多功能酶标仪检测波长在570 nm处吸光度(OD)值。

1.5.2 采用流式细胞仪检测细胞凋亡

于96孔板中接种各组肺癌细胞常规培养，24 h后弃培养液，含乙二胺四乙酸的胰酶消化细胞，离心5 min, 2 000 r/min, 弃去上清液，PBS清洗。计入500 μl结合缓冲液，10 μl碘化丙啶(PI)及5 μl膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(AnnexinⅤ-FITC),混匀，无光孵育5 min, 流式细胞仪测细胞凋亡。

1.5.3 H2O2 跨膜转运的检测

取各组肺癌细胞，在6 cm培养皿中进行接种操作，数量控制在1×105个/ml。将慢病毒包装质粒和目的质粒通过脂质体转染法转染到肺癌细胞中。确保细胞无污染，转染48 h后，收集培养上清液进行离心及过滤，较高滴度前提下进行转染。病毒于-80 ℃冰箱中冷冻保存。取对数生长期的肺癌细胞，胰酶消化，在6孔板以5×105个/ml进行接种，2 ml/孔，置于37 ℃且体积分数为5%的CO2条件下培养细胞，细胞生长至70.0%～80.0%传代，100 μmol/L的H2O2完全培养基作用6 h, 消毒舍弃旧培养基，更换37 ℃ 10 μmol/L的2,7-双氯荧光素蛋白乙酸盐(DCFH-DA)孵育30 min, 以上流程完成后，进行细胞的消化和收集，通过激光共聚焦检测细胞内代表ROS(主要为H2O2)水平的绿色荧光强度。

1.5.4 荧光法分析肺癌细胞ROS水平

对达到对数生长期的A549细胞进行胰酶消化处理，在6孔板中接种，细胞生长实现80%的孔面积后，消毒舍弃旧培养基，加入无血清培养液继续培养，12 h后更换培养液，每组均设3个复孔。每组取1×105个细胞，加入DCFH-DA 1 ml, 浓度设置10 μmol/L,与细胞混匀后，避光静置20 min, 磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次去除细胞外DCFH-DA溶液，通过荧光强度分析ROS水平。

1.5.5 比色法记录氧化应激相关指标SOD、MDA含量

培养细胞生长至培养皿约80%时进行消化，培养皿密度选择4×105/ml, 在60 mm×15 mm培养皿中进行接种，细胞生长至16 h贴壁后更换加入不同剂量药物的完全培养液，24 h后收集培养上清液，参照试剂盒说明书加入试剂，与细胞混匀后，避光静置10 min, 将双蒸水调零，光径设置1 cm, 在532 nm及550 nm处分别测SOD、MDA各组上清OD值，记录氧化应激相关指标SOD及MDA含量。

1.5.6 Western印迹检测PI3K、p-PI3K、PKC、p-PKC表达

取各组细胞进行胰酶消化，离心机12 000 r/min离心5 min取上清液，按照4∶1的比例加入裂解液稀释蛋白样品后，沸水浴中煮沸5 min, 用二喹啉甲酸(BCA)法测总蛋白浓度，每个孔的蛋白水平为20 μg, 十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。冰箱设置4 ℃对转印缓冲液预冷，然后全部转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加入脱脂奶粉，全程封闭时长为1 h。加入PI3K、p-PI3K、PKC、p-PKC一抗(稀释比例1∶500)进行3次TTBS漂洗，每次10 min, 过夜温度设置4 ℃。然后加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗(稀释比例1∶2 000)进行3次TTBS漂洗，每次10 min, 37 ℃孵育45 min, 取二氨基联苯胺(DAB)试剂盒分别在1 ml水中加A、B、C液各1滴，酶催化底物发光液(ECL)涂布于膜上条带相应位置，于LAS4000Mini型化学发光成像分析仪中曝光；用JY-Clear图像分析软件分析目标条带的蛋白光密度值。

1.6 统计学分析

采用SPSS22.0软件进行方差分析、t检验。

2、结 果

2.1 各组肺癌细胞增殖情况检测结果

肺癌组肺癌细胞OD值明显高于姜黄素低、中、高组(P<0.05),姜黄素低组肺癌细胞OD值明显高于姜黄素中、高组(P<0.05),姜黄素中组肺癌细胞OD值明显高于姜黄素高组(P<0.05)。见表1。

2.2 各组肺癌细胞凋亡检测结果

肺癌组细胞凋亡率[(3.45±0.02)%]明显低于姜黄素低组、姜黄素中组及姜黄素高组[(9.08±0.43)%、(12.54±0.21)%及(22.36±2.48)%;F=237.2000,P<0.001],姜黄素低组细胞凋亡率明显低于姜黄素中组(t=17.710,P<0.01),与姜黄素中组相比，姜黄素高组肺癌细胞凋亡率明显升高(t=9.665,P<0.001),见图1。

2.3 各组肺癌细胞中H2O2的跨膜转运水平

与肺癌组相比、姜黄素各剂量组肺癌细胞内代表ROS(主要为 H2O2)水平的绿色荧光增强，且以姜黄素高组荧光最强，可知姜黄素可促进 H2O2 的跨膜转运。见图2。

表1 各组肺癌细胞A549增殖对比

图1 各组肺癌细胞凋亡   

图2 各组肺癌细胞H2O2跨膜转运水平(免疫荧光染色，×200)   

2.4 各组肺癌细胞中氧化应激水平检测结果

与肺癌组相比，姜黄素低、中、高组SOD、ROS水平明显升高，MDA水平明显降低(P<0.05),与姜黄素低组相比，姜黄素中、高组肺癌细胞中SOD、ROS水平明显升高，MDA水平明显降低(P<0.05),与姜黄素中组相比，姜黄素高组肺癌细胞SOD、ROS水平明显升高，MDA明显降低(P<0.05)。见表2。

2.5 各组肺癌细胞中PI3K、p-PI3K、PKC、p-PKC蛋白水平

肺癌组肺癌细胞中PI3K、p-PI3K、PKC、p-PKC蛋白水平明显高于姜黄素低、中、高组(P<0.05),姜黄素低组肺癌细胞中PI3K、p-PI3K、PKC、p-PKC蛋白水平明显高于姜黄素中、高组(P<0.05)。姜黄素中组肺癌细胞中PI3K、p-PI3K、PKC、p-PKC蛋白水平明显高于姜黄素高组(P<0.05)。见表2、图3。

表2 各组肺癌细胞中SOD、MDA、ROS水平、PI3K、p-PI3K、PKC、p-PKC蛋白水平比较

图3 各组肺癌细胞中PI3K、p-PI3K、PKC、p-PKC蛋白表达   

3、讨 论

全球范围内，肺癌的发病率及死亡率均呈现出逐渐上升的趋势。肺癌在世界上的发病率在所有癌症中排名第三，死亡率排名第二，至今对人类的生命安全仍有较大的威胁[8]。

相关研究结果显示[9],姜黄素对肿瘤细胞增殖的作用明显，在体内外均可进行抑制。有文献报道[10],姜黄素可特异性地减少编码融合蛋白表达，对激活的Ra8信号途径进行阻断下调，从而实现抑制K562细胞增殖的目的。有实验结果表明[11],姜黄素不但可以下调B细胞淋巴瘤(Bcl-2)患者腹水细胞CA46的c-myc, 还能抑制Bcl-2、突变型p53蛋白和mRNA的过度表达，通过提高Fas蛋白和mRNA的水平减少癌细胞增殖。在本文中，在经过姜黄素干预后，同时肺癌细胞增殖能力降低、凋亡能力增加，且均呈现出一定的剂量依赖性。杨秦梅等[12]研究提出，姜黄素可通过调控Notch信号通路促进肺癌细胞凋亡并抑制其增殖。本研究说明，姜黄素可以抑制肺癌细胞增值，促进其凋亡。

H2O2由ROS产生，研究发现[13],临床常用的紫杉醇和顺铂等抗肿瘤药物会升高肿瘤细胞中ROS的水平，造成原有氧化还原系统紊乱，破坏代谢通路，提高诱导细胞凋亡的风险。H2O2作为一种信号分子在多种生物进程中也发挥着重要作用。研究者发现[14],H2O2对癌细胞的影响是抑制作用还是促进作用取决于H2O2的浓度。低浓度的H2O2会加速肿瘤细胞生长，而适当偏高浓度的H2O2可以通过调节细胞内某些信号通路实现抑制癌细胞增殖的作用。研究表明[15],H2O2对肿瘤抑制基因的表达，包括细胞周期进程、细胞凋亡、肿瘤血管形成、癌细胞的迁移和侵袭等过程都具有调节作用。乳腺癌细胞的相关研究显示[16],50～200 μmol/L H2O2能够抑制癌细胞的增殖，而在肝癌细胞的研究中[17],1～10 μmol/L H2O2会促进癌细胞的增殖。研究证实[18],存在于细胞内复杂的氧化还原平衡，影响细胞的正常代谢、增殖、分化及凋亡。氧化应激水平会调控肿瘤细胞凋亡周期和增殖，ROS低含量时，肿瘤细胞快速增殖、代谢和转移，信号通路分子呈现表达，促进肿瘤癌变；ROS高含量时，通过抑制肿瘤细胞的生长，提高癌细胞凋亡率。在生物进化的过程中，细胞酶系统，包括SOD等，可直接解除ROS对细胞的攻击。细胞内出现的主要氧化损伤属于细胞膜脂质过氧化，而MDA作为细胞膜脂质过氧化的终产物之一，在氧化损伤出现时，增加MDA生成量，增量后的MDA又会引发细胞多方面的连锁损伤。姜黄素是从中药姜黄、郁金、莪术等职务中的根茎中提取的一种天然黄色酚类色素，其抗肿瘤效应近年来备受关注。有研究证实[19],姜黄素有确切的抗肿瘤、抗氧化、抗转移、抗血管生成等作用。于洪丹等[20]通过体外细胞实验研究表明，姜黄素可通过调控YAP信号通路促进氧化应激反应，进而抑制肝癌细胞活性，诱导其凋亡。本研究结果提示，姜黄素可通过提高H2O2转运，促进调控氧化应激反应，从而影响肺癌细胞生物学行为。

PI3K作为特异性催化磷脂醇(PI)3位羟基磷酸化，可分泌肌醇酯质产物激酶。细胞的增殖、分化、凋亡及迁移可通过PI3K信号通路进行调节。近年来有研究结果表明[21],在肿瘤细胞的发育、活化、增殖及分化过程中，都有PI3K的参与。激活后的PI3K通过转移到细胞膜，催生3,4,5-磷酸磷脂酰肌醇(PIR)。而PKC也可以被PI3K激活，从而对细胞分泌、肌肉收缩、细胞扩增和分化等很多体内的生理过程进行干预。PKC可以激活PI3K信号通路，PKC可以与钙调蛋白结合，控制细胞膜的结合。已有研究结果证实[22],肿瘤转移能力与膜PKC活性息息相关，高转移细胞的膜PKC活性明显高于低转移细胞的膜PKC活性。另有研究发现[23]姜黄素可通过PI3K/蛋白激酶B(AKT)信号通路调节多种肿瘤细胞的生物学行为。在本研究中发现，在经过姜黄素的干预后，PI3K、PKC水平有所降低，且具有一定的药物剂量依赖性。娄芮等[24]在对肺癌的研究中提出，通过抑制PI3K/AKT/PKC通路水平，促进肺癌细胞的凋亡，并抑制其增殖。李优等[25]在对肺癌的研究中提出，姜黄素通过调控PI3K/AKT通路水平，抑制肺癌细胞上皮间质转化，降低癌细胞的迁移能力。薛晓伟等[26]在研究中提出，抑制H2O2水平可通过调控PI3K/AKT通路，促进腺髓质嗜铬细胞瘤细胞凋亡。

本研究与上述研究结果相似。姜黄素可能是由于抑制H2O2水平进而调控PI3K/PKC通路，抑制肺癌细胞增殖。

参考文献:

[3]李恬,宋少莉,黄钢.中医药治疗肺癌的免疫机制研究进展及治疗现状[J].中医药学报,2020;48(1):62-6.

[4]彭芳华,马玄,胡秀英.姜黄素抑制乳腺癌细胞株Survivin表达及其增殖的影响[J].西部中医药,2017;30(7):17-9.

[5]孟玲玉,朱开梅,顾生玖,等.姜黄素对胃癌MGC-803细胞磷酸化-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶表达的影响[J].广西医学,2017;39(5):674-7.

[6]赵莹,李英姿.姜黄素对非小细胞肺癌 A459细胞增殖及 CDH13甲基化状态的影响[J].山东医药,2017;57(6):9-12.

[7]汤玲玲,倪振华,陈清阁,等.姜黄素对人肺鳞癌细胞NCI-H292黏蛋白5AC表达的影响及机制[J].山东医药,2019;59(2):32-5.

[9]董晓丹,穆素红.姜黄素抑制肾癌A498细胞增殖及其机制研究[J].解放军医药杂志,2020;32(1):43-6.

[10]于鑫,卢发强,宗成国,等.姜黄素诱导K562细胞自噬的抗瘤作用研究[J].中国实验诊断学,2019;23(11):1965-9.

[11]朱红波,周丽.姜黄素对Raji细胞凋亡及bFGF表达影响的观察[J].中华肿瘤防治杂志,2013;20(8):596-9.

[12]杨秦梅,崔青荣,李彬,等.姜黄素调控Notch信号通路对肺癌干细胞增殖及凋亡的影响[J].现代肿瘤医学,2018;26(20):34-9.

[19]姚庆华,林妙,汪玉琪,等.氧化应激在姜黄素诱导肺癌细胞凋亡中的作用及机制研究[J].中华中医药杂志,2016;31(2):614-8.

[20]于洪丹,张舒文,谷学静.YAP信号通路在姜黄素诱导HepG2肝癌细胞系凋亡中的作用[J].锦州医科大学学报,2020;41(3):13-8.

[23]范世珍,陈旭娜,于波海,等.姜黄素通过抑制PI3K/Akt/mTOR促进SiHa细胞自噬[J].中国实验诊断学,2017;21(5):897-900.

基金资助:江西省卫生健康委科技计划项目(202140649);

文章来源:王志强,周斌锋,彭兵锋等.姜黄素介导过氧化氢对肺癌细胞A549氧化应激及PI3K/PKC通路的影响[J].中国老年学杂志,2023,43(20):5038-5042.