肝纤维化(HF)是指肝脏细胞外基质(ECM)的异常增生和弥漫性过度沉积，是肝脏慢性炎症的病理性修复反应[1]。HF的发展会造成肝脏组织结构损伤变形，导致肝硬化的形成，而肝硬化易引发上消化道出血、肝性脑病、肝肾综合征等并发症，并增加肝脏癌变的风险，严重危害患者健康[2,3]。HF形成机制复杂，多种刺激因素均可引起HF形成，而肝星状细胞(HSC)的激活是肝HF的中心环节[4]。在正常状态下，静息状态的HSC主要参与维生素A和脂肪的代谢储存，并通过合成基质金属蛋白酶(MMP)及MMP组织抑制剂(TIMP)调控ECM的合成与降解，维持以胶原为主要成分的ECM的动态平衡[5]。而肝脏受到损伤产生炎症时，HSC即被激活，表达α-肌动蛋白(α-SMA),向肝肌成纤维细胞表型转化，并大量合成分泌ECM,导致ECM的异常沉积引起HF[6]。应对HF的复杂发病机制，中医药能同时针对多种靶点，在治疗方面有其独特的优势，近年来，探讨中医药对HF的治疗作用和机制已成为研究热点[7,8]。加味柴胡当归汤根据“肝体阴而用阳”的生理特点，以“养血柔肝”调节肝脏稳态平衡，从而达到改善HF效果，临床上用于治疗乙肝肝硬化腹水，能明显减轻患者的临床症状。通过网络药理学分析发现，该方与肝纤维化具有较多的共同靶点基因，其中与磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/B细胞淋巴瘤(Bcl)-2信号通路关联尤为密切，而PI3K/AKT/Bcl-2信号通路与HSC的活化增殖及ECM合成密切相关[9]。因此，本研究构建HF大鼠模型及HSC细胞HF模型，通过在体动物实验及体外实验对加味柴胡当归汤抗HF的疗效及PI3K/AKT/Bcl-2信号通路相关机制进行探究。

1、材料与方法

1.1 细胞来源

大鼠HSC(HSC-T6 细胞)购自中国科学院昆明细胞库，于-80 ℃冻存，37 ℃,5% CO2恒温培养箱中培养。

1.2

细胞培养箱(太仓艺斯高医疗器械科技有限公司);流式细胞仪(Thermo Fisher Scientific 公司);凝胶电泳仪(美国 BIO-RAD 公司);聚合酶链反应(PCR)仪(Thermo Fisher Scientific 公司，美国);酶标仪(Thermo Fisher Scientific 公司);四氯化碳；橄榄油；α-SMA、Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ)、MMP-2、MMP-9、TIMP-1酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购自武汉菲恩生物科技有限公司；反转录试剂盒(Takara 生物公司);杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)和胎牛血清(FBS)购自gibco; 血小板衍生生长因子(PDGF)-BB(美国MCE公司),PI3K激活剂、PI3K抑制剂购自美国MCE公司；CCK8试剂盒、细胞凋亡试剂盒购自Biosharp 生物科技有限公司。中药方剂加味柴胡当归汤组分：柴胡、黄芩、桂枝、干姜、生牡蛎(先煎)、川芎、当归、白芍、茯苓、炒白术、泽泻、党参、天花粉、五味子(打碎)、鸡骨草、垂盆草、三七粉、鳖甲(先煎)、棉茵陈、炙甘草，全部购自柳州市中医医院中药房。

1.3 分组

解冻HSC-T6细胞，于含10% FBS的完全培养基中贴壁培养。传代稳定后接种于6孔板，分为正常对照组，模型组，中药组，激动剂+中药组，抑制剂+中药组共5组，每组3个复孔。正常对照组无任何药物干预，模型组以PDGF-BB(20 μg/L)干预，中药组以PDGF-BB(20 μg/L)+加味柴胡当归汤含药血清干预，激动剂+中药组以PDGF-BB(20 μg/L)+HY-101625(20 μmol/L)+加味柴胡当归汤含药血清干预，抑制剂+中药组以PDGF-BB(20 μg/L)+LY294002(20 μmol/L)+加味柴胡当归汤含药血清干预。

1.4 HSC-T6细胞培养及给药干预

取出-80 ℃冰箱中储存的HSC-T6细胞冻存管，置于预热的37 ℃水浴锅中快速解冻，消毒后放入生物安全柜，吸取细胞冻存液加入含10%FBS的完全培养基中重悬，离心后接种于细胞培养瓶或培养皿中，放入37 ℃,5%CO2细胞培养箱中贴壁培养。按方配制加味柴胡当归汤，依照动物与人的公斤体质量剂量折算系数表计算，以3 g/100 g/d对大鼠进行灌胃，持续7 d后采血，制备大鼠含药血清。设置1%、2%、5%、8%、10%、15%、20%加味柴胡当归汤含药血清浓度梯度对HSC-T6细胞进行干预实验，选取含药血清对HSC-T6细胞增殖抑制作用达到峰值的最低浓度作为后续实验用药剂量。根据分组，分别对HSC-T6细胞以PDGF-BB 刺激增殖，使用PI3K激活剂(HY-101625)、抑制剂(LY294002)及加味柴胡当归汤含药血清进行干预，培养24 h后进行实验。

1.5 各组细胞增殖和凋亡水平检测

消化收取细胞，制备细胞悬液。将各组细胞接种于96孔板，按照CCK-8试剂盒说明进行操作，酶标仪检测并计算细胞增殖活性。取各组细胞悬液，按照细胞凋亡试剂盒方案染色，使用流式细胞仪检测细胞凋亡水平。

1.6 各组细胞α-SMA、COL-Ⅰ、MMP-2、MMP-9、TIMP-1表达水平检测

收取各组HSC-T6细胞上清液，使用ELISA试剂盒分别测定细胞α-SMA、COL-Ⅰ、MMP-2、MMP-9、TIMP-1表达水平。

1.7 各组细胞Bcl-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9蛋白表达水平

取上述总蛋白提取液，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白含量并计算上样量，采用Western印迹法分析测定HSC-T6细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9的蛋白表达。

1.8 各组细胞PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p-mTOR的mRNA表达水平

收取各组细胞，加入TRIzol提取总RNA,依照反转录试剂盒说明获取cDNA,采用qRT-PCR法测定细胞PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR的mRNA表达。

1.9 统计学方法

采用SPSS24.0软件，两两比较用SNK-q分析，多组间比较用单因素方差分析。

2、结果

2.1 细胞增殖活性和凋亡水平

PDGF-BB刺激后，模型组HSC-T6细胞增殖活性明显高于正常对照组，而凋亡率明显下降(P<0.05);而中药组、激动剂+中药组、抑制剂+中药组与模型组比较，HSC-T6细胞的增殖活性被明显抑制，凋亡率显著升高(P<0.05)。见表1。

2.2 各组细胞α-SMA、COL-Ⅰ、MMP-2、MMP-9、TIMP-1表达水平

与正常对照组相比，模型组细胞α-SMA、COL-Ⅰ、TIMP-1表达水平显著升高，MMP-2、MMP-9表达量显著降低(P<0.05);中药组、激动剂+中药组、抑制剂+中药组相较于模型组α-SMA、COL-Ⅰ、TIMP-1表达水平明显减少，MMP-2、MMP-9表达水平则明显上升(P<0.05)。见表1。

表1 各组细胞增殖活性、凋亡及α-SMA、COL-Ⅰ、MMP-2、MMP-9、TIMP-1表达水平

2.3 各组细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平

与正常对照组相比，模型组HSC-T6细胞Bcl-2明显上调，Bax明显下调，Caspase-3和Caspase-9表达显著降低(P<0.05);与模型组相比，中药组、激动剂+中药组、抑制剂+中药组细胞Bcl-2表达水平明显降低，Bax、Caspase-3和Caspase-9表达显著升高(P<0.05)。见表2。

2.4 各组细胞PI3K/AKT/mTOR通路mRNA表达水平

相较于正常对照组，模型组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR mRNA表达显著上调(P<0.05);中药组、激动剂+中药组、抑制剂+中药组细胞相比于模型组，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR mRNA表达均明显下调(P<0.05)。见表2。

表2 各组细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白及PI3K/AKT/mTOR通路mRNA表达水平

3、讨论

HF是大部分慢性肝病的共同病理变化过程，主要表现为肝脏ECM的异常增生和过度沉积，而其进一步发展会导致肝脏组织结构损害和功能障碍，是各种慢性肝病向肝硬化发展的关键环节[10]。根据报道，肝硬化患者转化为肝癌的发病率为3%～6%,而约80%的肝癌是发生在肝硬化的基础上[11],同时肝硬化失代偿期易引发各种并发症，对患者的健康和生命造成极大威胁。临床研究表明，肝硬化失代偿期几乎无法逆转，而HF是一个较为长期的动态发展过程，及时发现并治疗尚有逆转的可能[12]。因此，及时控制并逆转HF发展，阻断肝硬化进程，对于延缓慢性肝病发展和降低肝癌发病率具有重大意义。HF是涉及多种机制的复杂病理过程，病因繁多，针对单一靶点的治疗难以取得理想的治疗效果，因此还未见有专用于治疗HF的化学药物和生物制剂的临床药物上市。而中药复方制剂含有多味中药，其主要理念是通过各种药物配伍协同作用从多种机制共同调节机体平衡，能够同时针对多种靶点对疾病进行治疗，故应对HF这类复杂病程具有独特优势[13]。

本实验所用方剂加味柴胡当归汤，以“肝主藏血，肝体阴而用阳”的生理特点为理论基础，采用“养血柔肝”法，由《伤寒论》中的柴胡桂枝干姜汤和《金匮要略》中的当归芍药散及四君子汤加五味子、三七、鳖甲、鸡骨草、垂盆草、茵陈而组成。方中以柴胡、桂枝配伍黄芩恢复肝之疏泄功能，调气行血；以当归、白芍、川芎为四物汤去掉熟地，以养肝血，补而不滞，配伍天花粉、五味子益肝阴；以党参、白术、茯苓、甘草四君子汤健脾益气，补气生血；配伍干姜为理中丸之意，温中祛寒，四君合理中助脾阳之运化，即“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”;加三七、鳖甲、牡蛎活血软坚散结，加鸡骨草、垂盆草药清热解毒、利湿退黄。全方共用以养血柔肝，标本兼治，在临床应用上能显著改善患者临床症状、肝功能和HF指标，对于HF具有较好的疗效。经过初步网络药理学探究，本文发现加味柴胡当归汤治疗HF的核心靶点主要有 AKT、白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)、IL-1β、Bcl-2等，与PI3K/AKT信号通路密切相关。有研究表明，PI3K/AKT 信号通路可调控HSC的活化、增殖和ECM合成，通过调控PI3K/AKT信号通路能够激活HSC[14];Bcl-2和Bax是AKT的底物，Bcl-2为抑凋亡蛋白，Bax为促凋亡蛋白，Bcl-2/Bax的调节在HF进展中发挥重要作用[15,16]。

本实验表明，加味柴胡当归汤对活化HSC-T6细胞有抑制作用；同时，PI3K抑制剂能使抑制效果增强，而PI3K激动剂能使抑制效果减弱，证明加味柴胡当归汤对HSC活化的抑制机制与PI3K/AKT/Bcl-2信号通路密切相关。ECM异常增生和沉积是HF进展的核心，而HSC是ECM的主要来源[17]。肝脏受到刺激或发生损伤会使HSC活化，其特异性标志为α-SMA的表达异常升高，激活的HSC会上调COL-Ⅰ等ECM的分泌[18]。此外，HSC主要通过MMP与TIMP的动态平衡来调节ECM的合成与降解，MMP可促使ECM的主要成分胶原蛋白降解，而TIMP能抑制MMP活性从而减少ECM的降解，MMP和TIMP失衡会导致ECM的异常增加，加速HF的进程[19,20]。本研究结果验证了该方药对HSC纤维化的逆转作用。PI3K/AKT/mTOR信号通路是促进细胞增殖分化、蛋白代谢及抗凋亡的关键通路，PDGF-BB能使PI3K发生磷酸化活化，进而激活PI3K/AKT/mTOR信号通路。本实验中，加味柴胡当归汤显著降低了活化HSC-T6细胞PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平，证明了其对HSC-T6细胞纤维化的抑制作用。

综上，加味柴胡当归汤可通过调控PI3K/AKT/Bcl-2信号通路，抑制HSC激活，从而减少ECM分泌沉积，逆转HF进程；为临床上肝硬化阻断和慢性肝病及肝癌预防和治疗提供新的思路和方向。

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基金资助:国家自然科学基金项目(8216150339);广西中医药大学研究生教育创新计划项目(YCBXJ2022025);

文章来源:孙素红,周晓玲,李泽鹏等.基于PI3K/AKT/Bcl-2信号通路探讨加味柴胡当归汤抑制肝星状细胞纤维化的机制[J].中国老年学杂志,2023,43(20):5019-5023.