首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 肿瘤科论文 > 肺癌论文 > 人参皂苷Rg3抑制肺癌细胞增殖和侵袭的作用及机制

人参皂苷Rg3抑制肺癌细胞增殖和侵袭的作用及机制

2023-10-29 124 上传者：管理员

摘要：目的探讨人参皂苷Rg3通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路抑制肺癌细胞增殖与侵袭的机制。方法体外培养人肺癌细胞(A549),分为对照组(正常培养),低剂量实验组(30μmol·L-1人参皂苷Rg3),高剂量实验组(60μmol·L-1人参皂苷Rg3)。用细胞计数试剂盒8(CCK-8)评估人参皂苷Rg3对肺癌细胞存活率的影响，用流式细胞术检测肺癌细胞经处理之后的凋亡率，用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测重要凋亡基因的表达，用Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力，同时检测细胞内的氧化应激状况，用蛋白质印迹法检测PI3K和Akt磷酸化的水平。结果对照组和低、高剂量实验组细胞活力分别为(98.67±0.88)%、(82.67±2.40)%和(74.77±3.09)%,B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)mRNA相对表达水平分别为0.96±0.04、0.87±0.02和0.71±0.01,caspase-3 mRNA相对表达水平分别为0.96±0.04、1.22±0.07和1.36±0.04,活性氧(ROS)水平分别为(99.70±3.45)%、(134.58±6.68)%和(145.72±8.96)%,细胞相对侵袭率分别为(95.33±2.72)%、(87.33±2.18)%和(78.00±1.73)%, p-Akt蛋白相对表达水平分别为1.08±0.11、 0.34±0.19和0.29±0.17,p-PI3K蛋白相对表达水平分别为1.09±0.09、 0.55±0.16和0.42±0.19。低、高剂量实验组上述指标与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。结论人参皂苷Rg3对人肺癌细胞具有抵抗作用，可能与PI3K/Akt信号通路相关。

关键词：
人参皂苷Rg3
侵袭
凋亡
磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B
肺癌细胞
加入收藏

肺癌是一种威胁人类健康的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居全球前列[1]。目前，肺癌治疗方式主要通过手术、放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗等[2]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信号通路参与许多病理生理过程，包括细胞增殖、生存、代谢、转移和凋亡等[3]。人参皂苷是一种自然存在于人参中的化合物，具有多种生物活性，包括增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤等作用[4]。本研究旨在探究不同浓度的人参皂苷对人肺癌细胞(A549)增殖和侵袭的影响及其与PI3K/Akt信号通路的关系。

一、材料与方法

1 材料

细胞株A549肺癌细胞，购于中科院上海细胞研究所。

药品与试剂人参皂苷Rg3,规格：每瓶20 mg,纯度：98%,批号：20220525,天津百倍生物科技有限公司生产。细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8, CCK-8)、活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测试剂盒，均购自碧云天生物技术公司；反转录试剂盒和FastStart Universal SYBR Green Master,均购自天津索罗门生物科技有限公司；PI3K p85抗体、p-PI3K抗体、山羊抗兔二抗、AKT抗体和p-AKT抗体，均购自Proteintech公司；基因引物，均由南京金唯智生物科技有限公司合成。

仪器NovoCyte Advanteon流式细胞仪，美国安捷伦科技有限公司产品；荧光倒置显微镜，日本奥林巴斯有限公司产品；酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific公司产品；实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)仪，美国伯乐生命医学产品(上海)有限公司产品。

2 实验方法

2.1 细胞培养和处理

细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，并置于37℃,5% CO2的细胞培养箱中培养，实验操作取对数生长期细胞。

2.2 细胞分组与给药方法

将长势良好数量相当的A549肺癌细胞置于新鲜的培养液中生长，分为对照组(正常培养)、低剂量实验组(30μmol·L-1人参皂苷Rg3)、高剂量实验组(60μmol·L-1人参皂苷Rg3)。

2.3 用CCK-8增殖试剂盒检测细胞增殖情况[2]2]

按照说明书进行操作，将每孔2×104细胞数置于96孔板中，按照“2.2”方法处理细胞24、48和72 h,之后按照指导书操作，最后测定在波长450 nm处光密度值。

2.4 用流式细胞术检测细胞凋亡指标[3]3]

细胞按照“2.2”方法处理24 h,经过磷酸盐缓冲液洗涤，用胰酶消化并收集，经过离心，弃上清液，随后加入染液Annexin V-FITC 5μL,混匀之后加入碘化丙啶10μL进行染色，在37℃静置5 min,随后使用流式细胞仪进行检测。

2.5 用qRT-PCR检测基因表达水平[2]2]

细胞按照“2.2”方法处理24 h,然后按照试剂盒指示提取mRNA并转录成cDNA,之后使用荧光染料进行PCR反应。反应程序为50℃中2 min, 95℃中10 min, 95℃中15 s, 60℃中1 min,共循环40次。本次实验的内参基因是β-actin,使用2 -△△Ct方法计算mRNA相对表达水平。

2.6 用Transwell侵袭实验检测癌细胞的侵袭能力[2]2]

用细胞培养液稀释细胞，以浓度为5 000 cell/100μL接种在Transwell小室中，小室放在细胞培养液600μL的24孔板中，转移到细胞培养箱放置72 h,之后使用磷酸盐缓冲液清洗小室，在底部滴无水甲醇，固定0.5 h,再滴加结晶紫色溶液进行染色10 min,洗涤小室，晾干之后显微镜观察并记录。

2.7 用流式细胞仪检测细胞ROS水平[2]2]

处理实验组细胞后，丢弃培养基，加入浓度为100 nmol·L-1 CFH-DA探针，孵育30 min后，收集细胞置流式细胞仪检测。

2.8 用蛋白质印迹(Western blot)法检测蛋白表达水平[3]3]

收集1×104细胞进行实验操作，按照BCA试剂盒进行提取蛋白，之后进行电泳，转膜与显色，使用Image J进行定量分析。

3 统计学处理

用GraphPad Prism 6软件对收据进行统计分析，用单向方差分析和图基(Tukey)事后检验法分析进行两两之间的差异比较。

二、结果

1 人参皂苷降低了肺癌细胞的增殖能力

体外培养人肺癌细胞(A549),分为对照组(正常培养)、低剂量实验组(30μmol·L-1人参皂苷Rg3)、高剂量实验组(60μmol·L-1人参皂苷Rg3)。

对照组、低剂量实验组和高剂量实验组在24 h的细胞活力分别为(98.67±0.89)%、(90.00±5.03)%和(79.33±6.98)%;48 h的细胞活力分别为(98.67±0.88)%、(86.67±4.05)%和(86.67±4.05)%;72 h的细胞活力分别为(98.67±0.83)%、(82.67±2.40)%和(74.77±3.09)%。处理48 h后，高剂量实验组细胞活力与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05),72 h时，低剂量实验组和高剂量实验组细胞活力与对照组比较，差异均有统计学意义(均P<0.001)。

2 人参皂苷Rg3对肺癌细胞凋亡的影响

对照组、低剂量实验组和高剂量实验组B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)mRNA相对表达水平分别为0.96±0.04、0.87±0.02和0.71±0.01,caspase-3 mRNA相对表达水平分别为0.96±0.04、1.22±0.07和1.36±0.04。低剂量实验组和高剂量实验组上述指标与对照组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

3 人参皂苷Rg3对肺癌细胞氧化应激的情况

流式细胞术实验结果表明，对照组、低剂量实验组和高剂量实验组ROS水平分别为(99.70±3.45)%、(134.58±6.68)%和(145.72±8.96)%,与对照组相比，低剂量实验组和高剂量实验组上述指标与对照组比较，差异均有统计学意义(均P<0.01)。

4 人参皂苷Rg3降低了肺癌细胞的侵袭能力

对照组、低剂量实验组和高剂量实验组细胞相对侵袭率分别为(95.33±2.72)%、(87.33±2.18)%和(78.00±1.73)%,高剂量实验组上述指标与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01),见图1。

图1人参皂苷Rg3对癌细胞侵袭能力的影响(40×)

5 人参皂苷Rg3对肺癌细胞中PI3K和Akt蛋白表达的影响

对照组、低剂量实验组和高剂量实验组细胞Akt蛋白相对表达水平分别为1.01±0.17、0.97±0.12和0.99±0.18,各组比较，差异无统计学意义(均P<0.05);p-Akt蛋白相对表达水平分别为1.08±0.11、0.34±0.19和0.29±0.17,与对照组比较，低、高剂量实验组p-Akt蛋白表达水平均显著降低(均P<0.01);PI3K蛋白相对表达水平分别为1.05±0.11、0.96±0.10和1.01±0.11,各组比较，差异均无统计学意义(均P>0.05);p-PI3K蛋白相对表达水平分别为1.09±0.09、0.55±0.16和0.42±0.19,与对照组相比，低、高剂量实验组p-Akt蛋白表达水平均显著降低(均P<0.001)。

三、讨论

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占所有肺癌的80%～85%,其5年生存率不到15%[5]。在过去的几十年里，尽管传统治疗在临床上取得了一些进展，但由于其独特的生理条件和肿瘤逃逸的频繁发生，NSCLC的总体生存率仍然不容乐观[6]。

人参皂苷Rg3已被证明具有显著的生理活性[7],如保肝、神经保护、心血管保护、促进免疫力，以及抗疲劳、抗氧化，最重要的是抗肿瘤作用[8]。证据表明，人参皂苷Rg3在许多癌症模型中发挥抗肿瘤作用，例如肺癌、肝癌和乳腺癌[9]。

相关研究表明，PI3K/Akt通路，该途径参与管理各种类型癌症的多种生物过程，其过度激活将导致细胞周期进程异常、黏附和运动改变、凋亡抑制和血管生成诱导[10],此外，PI3K/Akt通路已被发现与多种信号级联发生串扰。因此，PI3K/Akt和其他分子之间的广泛串扰形成高度相互依赖的信号网络，协同调节癌症细胞的多种细胞功能，并通过增强细胞增殖、迁移/侵袭和治疗抵抗来促进疾病进展[11]。

本研究结果表明，与对照组比较，加入不同浓度的人参皂苷Rg3在一定程度上可以降低肺癌细胞的活力与增殖，并且促进癌细胞的凋亡，同时Bcl-2 mRNA表达降低，Bcl-2蛋白可以抑制细胞凋亡，并保护细胞免受各种刺激和损伤的影响，这对于维持正常的生理功能和组织结构至关重要[12]。Caspase-3 mRNA表达增加，在正常的生理过程中，Caspase-3可以被激活并引起细胞凋亡。当细胞出现异常或受到损伤时，Caspase-3可以被启动，并分解细胞内的蛋白质，从而导致细胞死亡[13],这个过程对于组织修复、发育调控和免疫系统等方面都有着非常重要的影响。本研究结果表明，人参皂苷Rg3对癌细胞的损伤作用，促使其凋亡。本研究还发现经过人参皂苷Rg3处理过的癌细胞，细胞内的氧化应激增加。同时，本研究探究了PI3K/Akt信号途径中的重要蛋白，发现人参皂苷Rg3可以降低肺癌细胞中PIK3蛋白和Akt蛋白的磷酸化。本课题组推测人参皂苷Rg3可能通过抑制PI3K/Akt信号来抑制癌细胞的增殖和侵袭。

参考文献:

[1]李桂民,李耀辉,李哲,等.基于网络药理学和分子对接探讨沙参麦冬汤治疗肺癌的作用机制[J].世界中医药,2022,17(12):1685-1691.

[2]黄琳,李彬,胡作为.长链非编码RNA LINC00313通过铁死亡抵抗促进肺癌细胞的增殖和迁移[J].现代肿瘤医学,2023,31(9):1614-1618.

[3]赖瑞,史晓光,左禧萌,等.紫草素对乳腺恶性肿瘤细胞凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响[J].世界中医药,2023,18(6):788-791.

[4]高倩,王建宇,孟伟建,等.人参皂苷Rg1调控Sema4D/Plexin B1信号通路对老龄脑梗死大鼠神经功能的保护作用[J].中国老年学杂志,2023,43(1):155-158.

[7]刘倩倩,樊官伟.人参皂苷Rg3现代药理作用及作用机制的研究进展[J].中西医结合心脑血管病杂志,2022,20(13):2375-2381.

[9]蒋钰为,孙涛.人参皂苷Rg3对人乳腺癌细胞株MCF-7增殖及凋亡的影响[J].中医临床研究,2020,12(14):1-4.

[10]谭晖,王吉昌,董丹凤,等.五味子酯甲通过抑制CCAT1和PI3K-AKT信号通路抑制肺癌细胞的迁移和侵袭[J].世界中医药,2021,16(13):1966-1971.

[12]赵馨旭,黄林生,刘佳玲,等.Bcl-2转录抑制因子1在胃癌中的表达及其生物学功能[J].中国普通外科杂志,2022,31(4):481-489.

[13]曾富康,张宇星,周德生,等.核心钟基因Bmal1通过JNK/caspase-3信号通路抑制缺血再灌注损伤PC12细胞的炎症及凋亡[J].中国病理生理杂志,2022,38(11):1972-1980.

基金资助:黑龙江省应用技术研究与开发计划基金资助项目(GA19C109);

文章来源:韩宁,李秋实,王鑫洋等.人参皂苷Rg3抑制肺癌细胞增殖和侵袭的作用及机制[J].中国临床药理学杂志,2023,39(20):2942-2945.