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益肾十七味丸通路改善阿霉素肾病研究

2023-10-29 133 上传者：管理员

摘要：目的探讨益肾十七味丸对阿霉素诱导肾病模型小鼠焦孔素E(GSDME)、胱天蛋白酶3(caspase 3)表达的影响，及其保护机制。方法将50只BALB/c小鼠按照随机分组法分为正常组、模型组和低、中、高剂量实验组，每组10只。模型组和低、中、高剂量实验组采取尾静脉注射方式一次性注射10.5 mg·kg-1阿霉素，同时低、中、高剂量实验组分别灌胃给予150、240、330 mg·kg-1·d-1益肾十七味丸；正常组和模型组均灌胃给予等体积0.9%NaCl。5组小鼠均持续给药28 d。用酶联免疫吸附试验法检测血清白蛋白(ALB)及血清肌酸酐(SCr)水平，用免疫组织化学染色法检测GSDME介导的细胞焦亡通路关键分子的表达特征，用蛋白质印迹法检测GSDME和caspase 3蛋白的表达水平。结果中、高剂量实验组和模型组、正常组的血清ALB分别为(23.31±2.80)、(24.95±1.55)、(17.44±2.25)和(30.49±2.27)mg·mL-1,SCr分别为(27.16±1.37)、(25.52±1.20)、(34.41±2.12)和(23.04±2.78)μmol·L-1,caspase 3蛋白相对表达水平分别为0.81±0.17、0.47±0.21、1.25±0.14和0.43±0.11,caspase 3活化形式(caspase 3 17 kDa)蛋白相对表达水平分别为0.60±0.33、0.41±0.19、0.97±0.02和0.43±0.13,GSDME蛋白相对表达水平分别为0.69±0.11、0.39±0.07、1.17±0.12和0.41±0.03,N末端片段裂解形成焦孔素E氮端(GSDME-N)蛋白相对表达水平分别为0.82±0.17、0.41±0.05、1.30±0.02和0.76±0.11。中、高剂量实验组的上述指标与模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。结论益肾十七味丸通过调控caspase 3-GSDME焦亡通路，从而改善阿霉素肾病。

关键词：
焦孔素E
益肾十七味丸
肾病
胱天蛋白酶3
阿霉素
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肾病综合征是一种常见的肾疾病。阿霉素(adriamycin, ADR)诱导的小鼠肾结构和功能损伤的类型与人类慢性肾病非常相似[1]。研究慢性肾病的发生发展、治疗预后具有重要的意义。焦孔素E(gasdermin E,GSDME)是一种细胞焦亡执行者，其在多种癌症中发挥作用[2]。GSDME被激活后可诱导细胞焦亡，并导致其N末端片段裂解形成焦孔素E氮端(gasdermin E-N,GSDME-N)[3]。研究表明，激活的胱天蛋白酶3(cysteinyl aspartate-specific proteinase-3,caspase 3)可以切割GSDME以生成GSDME-N,其可转移至细胞膜并介导细胞穿孔，从而导致细胞焦亡的发生[4]。ADR可诱导细胞焦亡重要蛋白GSDME表达，并通过caspase 3的切割作用获得活性，诱导肿瘤细胞焦亡杀伤肿瘤细胞[5]。本实验室发现，阿霉素肾病模型中GSDME表达升高，说明GSDME介导的细胞焦亡参与阿霉素肾病肾损伤进程。益肾十七味丸是蒙医治疗肾损伤常用药物，能改善肾功能、延缓肾纤维化进程。本研究旨在探讨益肾十七味丸对ADR诱导肾病模型小鼠的GSDME和caspase 3表达的影响，评估该蒙药对阿霉素肾病的保护效果。

一、材料与方法

1 材料

动物雄性SPF级BALB/c小鼠，鼠龄7周，体质量(20±2)g,北京斯贝福生物技术有限公司提供。动物许可证号：SCXK(京)2019-0019。本实验经包头医学院医学伦理委员会批准(伦理批号：20220083)。

药品与试剂益肾十七味，规格：每瓶15 g,批号：2106015,批准文号：国药准字Z15020405,内蒙古蒙药股份有限公司生产；阿霉素，规格：每支10 mg,批号：S1208-13,美国Selleck Chemicals公司生产。小鼠血清肌酸酐(serum creatinine, SCr)、白蛋白(albumin, ALB)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒，均购自泉州市九邦生物科技有限公司；GSDME、caspase 3单克隆抗体，均购自Abclonal(中国)公司。

仪器Azure c300化学发光成像仪，美国Auze公司产品；3001多功能酶标仪，美国Thermo公司产品；ECLIPSE Ci-S生物显微镜，南京尼康公司产品。

2 实验方法

2.1 溶液配制

益肾十七味丸研磨后，经80目的筛网过筛后，用去离子水配制成66、48和30 mg·mL-1 3个质量浓度，置于4℃保存，备用。

2.2 模型建立[6,7]6-7]

采取尾静脉注射10.5 mg·kg-1 ADR的方法构建阿霉素肾病模型。

2.3 动物分组与给药方法

将50只雄性BALB/c小鼠，适应性饲养1周，随机分为正常组、模型组和低、中、高剂量实验组，每组10只。模型组和低、中、高剂量实验组采取尾静脉注射方式一次性注射10.5 mg·kg-1 ADR,同时对低、中、高剂量实验组小鼠每天晚上分别灌服150、240、330 mg·kg-1·d-1益肾十七味丸；模型组和正常组均给予等体积0.9%NaCl。5组小鼠均持续给药28 d。

2.4 用ELISA法检测血清ALB和SCr含量[8]8]

末次灌胃后，处死小鼠，收集血清，用ELISA法检测血清ALB和SCr含量。严格按照说明书进行操作，在480 nm处检测光密度值，计算SCr和ALB的含量。

2.5 用蛋白质印迹法检测肾组织中caspase 3与GSDME蛋白的表达情况[9]9]

样本中加入裂解液300μL,匀浆破碎裂解总蛋白。用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度，用裂解液稀释至相同浓度，5×蛋白上样缓冲液制备上样蛋白，煮沸5 min变性蛋白。制备分离胶与浓缩胶，加样后进行电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭，4℃过夜孵育一抗[甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH;1∶2 000)、GSDME(1∶500)、GSDME-N(1∶500)、caspase 3(1∶500)],然后再孵育二抗(1∶2 000)。用凝胶成像仪上显影，用Image J进行蛋白相对定量分析。

2.6 用免疫组织化学染色(immunohistochemistry stain, ISH)法测定caspase 3与GSDME蛋白的表达情况[10]10]

将肾组织浸入4%多聚甲醛和75%乙醇中，石蜡包埋。脱蜡和水化后，进行抗原修复和封闭处理。分别滴加GSDME和caspase 3的特异性抗体，4℃过夜孵育；滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠免疫球蛋白G二抗，37℃孵育30 min。二氨基联苯胺显色，冲洗，用苏木精重新染色，脱水并密封在中性橡胶中，用于最终的光学显微镜观察。

2.7 用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色与Masson染色法观察肾组织的病理学形态[9]9]

石蜡切片3～5μm, 60℃烤片30 min;二甲苯中脱蜡10 min,再换用新鲜二甲苯脱蜡10 min; 95%﹑70%﹑30%乙醇各2 min梯度脱水，最后蒸馏水2 min。按染色试剂盒说明书进行HE染色和Masson染色，透明及中性树脂胶封片后进行光镜观察。

3 统计学处理

用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料用

表示，2组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)。

二、结果

1 5组小鼠血清SCr和ALB的比较

低、中、高剂量实验组分别给予150、240、330 mg·kg-1·d-1益肾十七味丸；正常组和模型组均给予等体积0.9%NaCl。

模型组与正常组相比，血清ALB明显降低，SCr明显升高，差异均有统计学意义(均P<0.01)。低、中、高剂量实验组与模型组相比，血清ALB均明显增加，SCr均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结果见表1。

2 5组小鼠肾组织中caspase 3、caspase 3 17 kDa、GSDME、GSDNE-N蛋白表达水平的比较

低、中、高剂量实验组和模型组、正常组的caspase 3蛋白相对表达水平分别为0.94±0.11、0.81±0.17、0.47±0.21、1.25±0.14和0.43±0.11,caspase 3 17 kDa蛋白相对表达水平分别为0.59±0.16、0.60±0.33、0.41±0.19、0.97±0.02和0.43±0.13,GSDME蛋白相对表达水平分别为1.06±0.13、0.69±0.11、0.39±0.07、1.17±0.12和0.41±0.03,GSDME-N蛋白相对表达水平分别为0.96±0.08、0.82±0.17、0.41±0.05、1.30±0.02和0.76±0.11。模型组的上述指标与正常组比较，差异均有统计学意义(均P<0.01);低、中、高剂量实验组的上述指标与模型组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果见图1。

3 5组小鼠ISH后caspase 3、GSDME表达情况的比较

染色结果显示，与正常组相比，模型组小鼠肾中caspase 3的蛋白表达水平显著升高，在肾组织各部分均有表达，主要集中在肾小管细胞；与正常组相比，模型组小鼠肾中GSDME的蛋白表达水平也明显增高，也主要集中在肾小管和肾小囊；中、高剂量实验组小鼠肾中caspase 3、GSDME的蛋白表达均得到恢复，并随剂量的增加caspase 3、GSDME呈下降趋势。说明ADR可诱导GSDME型肾细胞焦亡，导致肾损伤，益肾十七味丸可抑制caspase 3-GSDME细胞焦亡通路，改善ADR肾损伤。结果见图2。

表1 5组小鼠血清肌酸酐(SCr)及白蛋白(ALB)水平的比较

图1益肾十七味丸对肾组织中胱天蛋白酶3(caspase 3)、焦孔素E(GSDME)、焦孔素E-氮端(GSDME-N)蛋白表达的影响

4 5组小鼠肾组织HE染色和Masson染色

HE染色和Masson染色结果见图3。正常组肾组织结构完整，肾小管和肾小球等状态良好。模型组肾组织明显改变，在光镜下观察肾组织，可见肾小管数量减少，肾小管出现空洞或萎缩，可见大量胶原纤维沉积，肾小球形态不规则、萎缩甚至消失，球囊粘连，部分毛细血管袢出现节硬化性改变；与模型组相比，中、高剂量实验组肾小球与肾小管异常形态较、胶原纤维沉积较模型组相比均有明显减轻，肾小管数量增加，各实验组随着益肾十七味丸剂量增加，改善效果越好。结果见图3。

图2 5组小鼠肾组织免疫组化染色(×200)

图3 5组小鼠肾组织病理改变苏木精-伊红(Ⅰ)和Masson(Ⅱ)染色(×200)

三、讨论

ADR是广谱抗肿瘤药物，被广泛应用于乳腺癌、肝癌和白血病等恶性肿瘤的治疗，作用于脱氧核糖核酸化学结构，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。ADR是被认可的动物肾疾病模型的诱导剂，主要积聚在肾中，但也存在于肝、心脏和小肠中[1]。阿霉素慢性肾病模型是较经典的慢性肾病动物模型，其病理上类似人类的局灶性节段性肾小球硬化。慢性肾病的发生机制较为复杂，研究认为肾炎症、氧化应激、足细胞损伤等与肾小球疾病病理有关[7]。慢性肾病的治疗方法有限，糖皮质激素、免疫抑制药为西医推荐药物，但并非在所有患者中有效，且存在真菌感染、病情复发等问题[11]。益肾十七味丸又名萨丽嘎日迪、十七味宝凤丸等，是蒙医治疗肾病的经典验方，出自《至高要方》。本方是诃子、制草乌、石菖蒲、木香、石决明(煅)、银朱、牛胆粉、黑云香、刀豆、茜草、红花、枇杷叶(制)、香墨、人工麝香、白豆蔻、大蜀季花、紫草茸组成的复方制剂。本方主要有滋阴补肾、固精、增加机体免疫力、消粘、补气健肾之功效，常用于肾盂肾炎、膀胱炎、腰膝疼痛、滑精、睾丸肿大肾寒肾热诸症、滑精、梦遗等病，有较好的疗效。临床研究表明，益肾十七味丸具有改善肾功能作用[12]。

ADR诱导的小鼠是目前模拟人慢性肾病较好的造模方法，出现的蛋白尿、肾功能衰竭接近人类肾病，在多篇文献中被应用[13]。本研究中小鼠造模4周后，其肾功能损伤进行性加重，与正常组比较，模型组血清ALB水平下降，SCr水平上升；与模型组比较，低、中、高剂量组的ALB均显著升高，SCr均显著下降，提示益肾十七味丸可改善肾病小鼠肾组织损伤。

GSDME属于孔蛋白家族，广泛表达于肾、心、脑等组织。GSDME是细胞焦亡的执行者。有研究结果显示，当用化疗药物治疗时，作为caspase 3能够作用于GSDME,caspase 3在高表达GSDME的癌细胞中诱导强烈的细胞焦亡[14]。SHEN等[5]研究推测，化疗药物(顺铂或ADR)诱导的肾小管上皮细胞焦亡是由活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)-c-Jun氨基末端激酶(c Jun NH2-terminal kinase, JNK)-caspase 3-GSDME信号介导的，此结果证明，靶向GSDME可在克服化疗药物诱导的肾毒性；进一步研究发现，通过基因缺失或药物治疗抑制caspase 3的作用可阻止GSDME的切割和细胞焦亡的发生，这说明GSDME在细胞焦亡的发生过程具有关键作用。在阿霉素慢性肾病模型中，NOD样受体家族pyrin域3(Nod like receptor family pyrin domain containing 3, NLRP3)、caspase 1、GSDMD等细胞焦亡通路关键因子蛋白表达水平明显升高，提示细胞焦亡参与慢性肾病的炎症过程[15]。这与本研究结果一致，即ADR诱导的肾组织细胞发生了细胞焦亡。然而，在现有的研究中，阿霉素肾病中细胞焦亡相关的分子机制仍未被完全阐明。同样，GSDME在阿霉素肾病发病机制中的作用尚不明确。

本研究首先证实在ADR诱导的小鼠肾组织中，发生了caspase 3切割GSDME介导的细胞焦亡现象。其次，益肾十七味丸治疗能抑制caspase 3、caspase 3活化形式，降低GSDME、GSDME-N表达，从而改善肾功能，说明肾十七味丸通过调节caspase 3-GSDME焦亡通路改善阿霉素肾病。

参考文献:

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[15]张娅.磁共振IVIM-DWI评估阿霉素肾病大鼠肾纤维化及骨髓MSCs缓解其炎症的实验研究[D].云南昆明:昆明医科大学,2022.

基金资助:内蒙古自治区自然科学基金项目(2020MS08015,2020MS08007);包头医学院花蕾计划基金资助项目(202126);

文章来源:张志凤,张学明,闫巧梅等.蒙药益肾十七味丸通过胱天蛋白酶3-焦孔素E通路改善阿霉素肾病小鼠的研究[J].中国临床药理学杂志,2023,39(20):2956-2960.