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ANLN敲除对肺腺癌细胞生物学功能的影响

2023-12-15 150 上传者：管理员

摘要：目的通过敲除肺腺癌细胞的Anillin肌动蛋白结合蛋白(ANLN)基因，验证其对肺癌细胞增殖、迁移等生物功能及行为学的影响。方法通过构建ANLN-siRNA质粒，电转染A549肺腺癌细胞，单克隆挑取、鉴定、扩大培养后得到实验组(ANLN-A549组),空载体质粒转染A549细胞得到对照组(Ctrl-A549组)。采用Transwell细胞迁移实验和细胞划痕实验检测2组肺癌细胞的迁移情况；采用CCK-8细胞增殖实验和细胞集落形成实验检测肺癌细胞的克隆增殖能力。结果 Transwell细胞迁移及细胞划痕实验结果表明，ANLN基因敲除后，ANLN-A549组肺癌细胞的迁移率较Ctrl-A549组显著下降，差异有统计学意义(P<0.05);CCK-8细胞增殖实验结果显示，ANLN-A549组较Ctrl-A549组细胞增殖明显减缓，差异有统计学意义(P<0.05);细胞集落形成实验表明，ANLN-A549组较Ctrl-A549组细胞群落数显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 ANLN基因的敲除显著抑制了肺腺癌细胞的增殖、迁移能力。

关键词：
Anillin肌动蛋白结合蛋白
增殖
肺腺癌
迁移
非小细胞肺癌
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肺癌作为一种发病率及病死率都比较高的恶性肿瘤，起源于肺部的支气管黏膜或腺体。肺癌在男女患者所患恶性肿瘤中，发病率占11.4%,肺癌一直是导致癌症患者死亡的首要原因，占所有癌症死亡的18%[1]。肺癌的发病率与吸烟、职业暴露(石、硅、镍、煤烟等)、慢性阻塞性肺疾病、遗传等因素有较明显的关系[2]。由于肺癌早期缺乏较特异性的临床表现，因此临床确诊时，患者大多已经处于肺癌的中期或晚期[3]。虽然近些年随着医学水平的进步，肺癌的治疗得到了有效的改进，但是当下患者的5年生存率还需进一步提升[4]。因此，科研工作者们对肺癌发生发展的分子机制进行进一步的探索研究，力图寻找新的、有潜力的、有效果的分子治疗靶点。

Anillin肌动蛋白结合蛋白(ANLN)最先是从果蝇的胚胎组织中提取到的一种蛋白质，研究者们发现其能够与F-肌动蛋白特异性地结合，因此将其命名为F-肌动蛋白结合蛋白[5]。在人类基因组中，ANLN基因(NM_018685)位于7p14.2,其含有24个外显子，编码相对分子质量为123×103的1 125个氨基酸残基[6,7,8]。在众多的肌动蛋白结合蛋白中，ANLN 作为细胞骨架中重要的组成成分，参与细胞的多种病理生理过程[9]。ANLN表达异常在多种癌症中起到重要的作用，但是在肺癌中的作用研究较少，因此本研究采用在A549细胞中敲除ANLN基因，探讨ANLN基因在肺腺癌细胞中增殖、迁移过程中的作用及部分机制，从而为寻找肺腺癌的治疗靶点提供新思路。

1、材料与方法

1.1 材料

A549肺癌细胞(上海市干细胞技术有限公司)。经由靶向ANLN-siRNA基因敲除技术得到的实验组(ANLN-A549组)及对照组(Ctrl-A549组)细胞均由广州源井生物科技有限公司制备。磷酸盐缓冲液(PBS)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA,0.25%),含酚红、DMEM高糖培养基、FBS胎牛血清均购于美国Gibco公司。CCK-8试剂盒购于Biosharp生物科技有限公司。Transwell 试剂盒购于美国Corning 公司。结晶紫染液购于生工生物工程股份有限公司。4%多聚甲醛购于上海凌峰化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

A549细胞(属于贴壁细胞)培养条件：首先配制含有 89%DMEM高糖培养基+10% FBS胎牛血清+1%双抗(青霉素和链霉素)的完全培养基，然后配制A549细胞悬液，后移至细胞培养瓶中，最后放置于细胞培养箱中，培养箱条件设定为温度37 ℃、5%二氧化碳(CO2)、饱和湿度。每天使用显微镜仔细观察所培养的细胞，并对细胞的生长状态作出分析判断，选择每2～3天更换 1 次完全培养基。当观察到细胞生长融合度占80%左右时，可以进行细胞的传代培养。

1.2.2 CCK-8 法检测细胞增殖

设计实验分组为ANLN-A549组、Ctrl-A549组及空白组。将ANLN-A549组及Ctrl-A549组细胞消化离心后加入新鲜的完全培养基，制成细胞悬液，计数并调整浓度为2×104个/mL。铺4张96孔板，分别将已经制备好的ANLN-A549组及Ctrl-A549组细胞悬液接种到96孔板中，空白组接种新鲜的完全培养基，每孔接种100 μL细胞悬液，每组5个复孔。同时在剩余空白孔加入PBS,防止液体蒸发影响实验结果。在5%CO2、37 ℃恒温条件下继续培养1 d。测定前，用10 μL移液枪在ANLN-A549组、Ctrl-A549组及空白组孔加入10 μL的CCK-8试剂，注意在加样过程中避免在孔中产生气泡，以免光密度(OD)值受到影响，混匀试剂后转移至培养箱，恒温孵育2 h。酶标仪测量每组细胞在波长450 nm 处的OD值，并连续测量3 d, 计算细胞的增殖倍数。

1.2.3 细胞集落形成实验

设计实验分组为ANLN-A549组、Ctrl-A549组。将ANLN-A549组及Ctrl-A549组细胞制成细胞悬液，计数并调整浓度为1×105个/mL。接种于6孔板上，调整每孔细胞数量800个左右，将6孔板置于培养箱中，37 ℃恒温培养14 d, 每3天采用显微镜观察1次，并更换完全培养基。当6孔板中出现集落，且每个集落的细胞数超过50个，吸弃完全培养基，PBS冲洗，4%多聚甲醛固定30 min, 然后PBS缓慢冲洗2～3次，后加入适量结晶紫染液，染色20 min, 最后PBS洗涤2～3次，将6孔板倒扣在网格纸上室温晾干，用数码相机拍照记录细胞的克隆数量。细胞集落形成率=(集落数/接种细胞数)×100%。

1.2.4 Transwell 细胞迁移实验

设计实验分组为ANLN-A549组、Ctrl-A549组。将ANLN-A549组及Ctrl-A549组细胞制成细胞悬液，计数并调整浓度为5×105个/mL。ANLN-A549组和Ctrl-A549组每组各3个Transwell小室，分组置于新的 24 孔板中，移液枪取100 μL无血清细胞悬液加入各个小室的上室，然后在各个下室内添加 500 μL含20%胎牛血清的完全培养基，培养箱中培养24 h。培养1 d后去除24孔板，用镊子夹住Transwell小室，弃去孔中培养液，PBS冲洗，4%多聚甲醛固定30 min, PBS缓慢冲洗2～3次，后加入适量结晶紫染液，染色20 min, PBS洗涤2～3次，擦去小室上层未转移的细胞，用镊子小心将每个Transwell小室膜取下，移至载玻片中央并用中性树胶封片。封片后，在显微镜下拍照观察，随机选取视野拍100×照片3 张，计数后分析。

1.2.5 细胞划痕实验

设计实验分组为ANLN-A549组、Ctrl-A549组。将ANLN-A549组及Ctrl-A549组细胞制成细胞悬液，计数并调整浓度为1×105个/mL。培养24 h后，吸弃6孔板中完全培养基，然后加入不含血清的培养基，用200 μL的枪头比着直尺，垂直于记号标线进行划痕，枪头始终保持垂直，尽量减少误差。划痕后使用PBS洗涤2～3次，除去划下的细胞，然后加入无血清培养基，将6孔板置于培养箱中恒温培养。选择0、12、24、48 h在荧光显微镜下进行拍照，根据所拍摄的照片，使用Image J软件打开图片后，计算细胞划痕面积均值，分析各组细胞迁移率，取 3 次的平均值。细胞迁移率(伤口愈合率)=(初始划痕面积-t时刻划痕面积)/初始划痕面积。

1.3 统计学处理

采用SPSS22.0统计软件对数据进行分析。2组数据间对比采用t检验，实验数据以ˉx±s表示，多组数据之间的对比用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1CCK-8法检测细胞增殖结果

培养12、24、48、72 h时，ANLN-A549组OD450值分别为0.727±0.038、0.820±0.020、1.293±0.025、1.638±0.029,Ctrl-A549组分别为0.794±0.014、0.923±0.024、1.793±0.020、2.592±0.026,空白组为0.342±0.003、0.369±0.005、0.318±0.005、0.308±0.004。ANLN-A549组细胞相比Ctrl-A549组，增殖明显减缓，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 A549细胞CCK-8增殖实验

2.2 细胞集落形成实验结果

分别将ANLN-A549组、Ctrl-A549组细胞接种于6孔板，培养14 d后，Ctrl-A549组与ANLN-A549组细胞的集落数分别为(157±14)、(55±9)个。2组细胞集落数比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 A549细胞集落形成实验

2.3Transwell 细胞迁移实验结果

ANLN-A549组、Ctrl-A549组迁移细胞数量分别为(109±8)、(322±17)个。ANLN-A549组较Ctrl-A549组的迁移数明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 A549细胞Transwell迁移实验

2.4 细胞划痕实验检测细胞迁移情况

Ctrl-A549 组与ANLN-A549组细胞培养24 h时，细胞迁移率分别为(0.33±0.04)%、(0.11±0.01)%,48 h 时为(0.39±0.01)%、(0.16±0.02)%。ANLN-A549组相比 Ctrl-A549组，在24、48 h时细胞迁移率有较明显的降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 A549细胞划痕实验

3、讨论

肺癌是对人类危害最严重的疾病之一，在世界范围内，肺癌的发病率及病死率均在各恶性肿瘤中处于高位，近年来呈持续上升的一种态势，且趋于年轻化。肿瘤的发生发展是一个多程序、多基因共同作用的结果，早期临床症状特异性差，诊断困难，大多数患者就诊时已处于肿瘤进展的中晚期。近些年来，随着科技水平的逐渐升高，分子生物学的发展迎来了较为明显的上升期，人们对肺癌的认识尤其是肺腺癌基因层次的发病机制愈发全面深刻，如调控肿瘤生长的原癌基因及调控抑制生长的抑癌基因，无论是原癌基因突变或是抑癌基因缺失，它们之间的协调失衡是肿瘤发生发展的重要原因。

ANLN是一种为细胞分裂所必需的保守的肌动蛋白结合蛋白，参与细胞的迁移和增殖[10]。ZHANG等[11]使用微阵列芯片技术对肝癌组织标本进行研究，结果发现，ANLN的CpG位点甲基化程度与Ctrl-A549组相比降低，而与此相反组蛋白中甲基化程度升高，敲除SMMC-7721肝肿瘤细胞中的ANLN基因，肝肿瘤细胞停留在G2/M期，从而达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。此外，在肝脏肿瘤组织标本中，ANLN大量表达在细胞核内，且癌组织表达量相比癌旁组织明显升高，与原发性肝癌相比转移灶中ANLN表达水平明显升高。ZENG等[12]敲除J82和5637膀胱癌细胞的ANLN基因，结果发现肿瘤细胞周期蛋白B1和D1的表达量明显减少，肿瘤细胞停留在G2/M期，从而使肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭能力下降。WANG等[13]在胰腺癌细胞系中发现LASP1的上调，而LASP1的上调可导致肿瘤的增殖、迁移、侵袭能力增加。与此相反，ANLN下调可以拮抗LASP1的作用，诱导miR-218-5p表达，而miR-218-5p与 LASP1的 3′非编码区(3′UTR)相结合。LI等[14]在生物信息学的研究中发现，ANLN、SCN11A、LY6D、ZNF488、MYEOV 等基因的表达量在胰腺癌患者预后中扮演重要的角色，随后研究发现，ANLN的表达与T淋巴细胞的浸润存在一定的关系，在T淋巴细胞减少的亚群中，ANLN表达量高的胰腺癌患者的预后相比于ANLN表达量低的患者预后更差，表明ANLN在胰腺癌患者的免疫治疗中存在一定的应用价值。ZHOU等[15]对71份乳腺癌肿瘤标本进行免疫组织化学分析，结果显示ANLN在癌组织中的表达较癌旁组织升高。随后通过基因敲除技术抑制ANLN基因在ZR-75-30和MDA-MB-231细胞中的表达，结果验证了敲除后的肿瘤细胞较未敲除的肿瘤细胞在增殖、侵袭及迁移等能力下降。上述结果表明，ANLN在肿瘤细胞中的上调可导致肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移能力增加，下调ANLN的表达可以拮抗这种作用。

本细胞实验结果表明，在不同时间节点，加入CCK-8试剂后ANLN-A549组的OD450值较Ctrl-A549组低，且随着细胞培养时间的延长，差距变大，因此本实验证明，敲除ANLN基因后的A549细胞增殖能力减弱。同样细胞集落形成实验结果显示，培养一定时间后，ANLN-A549组细胞在形成集落的数量上低于Ctrl-A549组细胞，印证了敲除ANLN基因可以有效抑制A549细胞的增殖能力。在细胞划痕实验中，ANLN-A549组细胞划痕操作后的24、48 h,细胞迁移率相比Ctrl-A549组细胞均表现出较为明显的降低，因此本实验结果显示，敲除ANLN基因后的A549细胞迁移能力明显下降。同时采用Transwell迁移实验对敲除ANLN基因的A549细胞的迁移率进行验证，结果发现，在培养一定时间后，ANLN-A549组迁移至小室膜另一侧的细胞数量明显少于Ctrl-A549组，再次证明敲除ANLN基因后可以有效抑制A549细胞的迁移能力。在DENG等[16]通过生物信息学研究发现，ANLN在肺腺癌中的表达升高，通过逆转录聚合酶链反应(qPCR)和蛋白质印迹法证实高表达的ANLN与肿瘤的预后不良、淋巴结转移和恶性程度呈正相关。本研究通过细胞实验，验证了其部分结果，显示ANLN的表达导致肺腺癌细胞的增殖、迁移能力增加。

本实验通过降低ANLN在肺腺癌细胞中的表达，结果显示肺腺癌细胞的增殖、迁移能力下降。因此，ANLN有望成为一个有效的分子治疗靶点，参与临床上对肺腺癌患者的治疗。未来仍需要进一步的研究来阐明ANLN分子的作用机制，为发展治疗肺癌的有效靶向药物提供理论和实验基础。

参考文献:

[1]曹毛毛,陈万青.GLOBOCAN 2020全球癌症统计数据解读[J/CD].中国医学前沿杂志(电子版),2021,13(3):63-69.

[3]朱小琼,蒋栋铭,沈佳莹,等.全球不同人类发展指数国家肺癌发病率和死亡率分析[J].上海预防医学,2023,35(4):305-313.

[8]徐丽萌.Anillin对细胞骨架蛋白和细胞力学特性的调节作用[D].太原:太原理工大学,2019.

基金资助:海南省自然科学基金高层次人才项目(SQ2022MSXM1128);

文章来源:朱思明,李标.ANLN敲除对肺腺癌细胞生物学功能的影响[J].现代医药卫生,2023,39(23):3961-3965.