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HSP70和S100A9蛋白在脑胶质瘤组织中的表达及其意义

2023-12-15 81 上传者：管理员

摘要：目的探讨热休克蛋白70(HSP70)和S100钙离子结合蛋白A9(S100A9)在胶质瘤组织中的表达水平及在低级别脑胶质瘤与胚胎发育不良性神经上皮肿瘤(DNT)中的鉴别诊断价值。方法所有病理标本取自2015年1月至2020年12月广东祈福医院和南部战区总医院确诊的160例胶质瘤初诊患者，其中世界卫生组织(WHO)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤患者均为40例。采用免疫组织化学法检测160例胶质瘤和肿瘤旁正常脑组织，以及20例DNT组织中HSP70和S100A9的表达水平。结果 HSP70和S100A9在160例胶质瘤组织中的阳性率分别为85.0%(136/160)和7.5%(12/160)。HSP70在不同WHO分级胶质瘤组织中的表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05),且表达水平随着胶质瘤WHO级别的增加而升高，也能用于低级别胶质瘤与DNT的鉴别诊断。S100A9在不同WHO分级胶质瘤的表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05),也不能用于DNT与低级别胶质瘤的鉴别诊断。HSP70与S100A9在脑胶质瘤组织中的表达无相关性。结论 HSP70可用于脑胶质瘤的诊断，表达水平随着胶质瘤WHO级别的增加而升高，且可用于DNT与低级别胶质瘤的鉴别诊断。S100A9无上述价值。

关键词：
S100A9蛋白
免疫组织化学
热休克蛋白70
胚胎发育不良性神经上皮肿瘤
胶质瘤
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作者前期进行了肿瘤实体组织比较蛋白质组学研究，鉴定出了较多低级别胶质瘤与胚胎发育不良性神经上皮肿瘤(DNT)的差异表达蛋白质[1]。其中，差异蛋白质热休克蛋白70(HSP70)属于HSP家族中最重要的成员，也是研究最为热门的一个，其具有“分子伴侣”功能，与蛋白质的合成、折叠、寡聚化和运输密切相关，在蛋白质的生物合成和细胞间运输起着纽带作用[2]。S100钙离子结合蛋白A9(S100A9)是S100家族的重要成员，与肿瘤的发生发展密切相关，具有促进肿瘤细胞增殖、侵袭转移和诱发肿瘤免疫抑制的作用[3]。HSP70与S100A9之间作用机制并无直接关联，选做验证研究是因为在前期新鲜组织用同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)对比研究中发现这2种蛋白质在低级别胶质瘤组织与DNT组织中的表达有显著差异，为作进一步的验证，本研究显著增加样本量，采用石蜡标本进行回顾性研究。

本研究采用免疫组织化学法检测胶质瘤组织中HSP70和S100A9的表达情况，分析这2种蛋白质在胶质瘤临床分期和预后中的意义，为胶质瘤的诊断和鉴别诊断、临床分期和预后判断寻找新的生物学标志物。

1、资料与方法

1.1 一般资料

所有病理标本取自2015年1月至2020年12月广东祈福医院和南部战区总医院确诊的160例胶质瘤初诊患者，根据2016年世界卫生组织(WHO)胶质瘤诊断标准进行分级，WHO Ⅰ级胶质瘤40例，包含毛细胞型星形细胞瘤34例、毛黏液样型星形细胞瘤4例、室管膜下巨细胞星形细胞瘤2例；WHO Ⅱ级胶质瘤40例，包含弥漫性星形细胞瘤23例、少突胶质细胞瘤12例、混合型少突-星形细胞瘤5例；WHO Ⅲ级胶质瘤40例，包含间变性星形细胞瘤32例、间变性少突胶质细胞瘤8例；WHO Ⅳ级胶质瘤40例，包含星形细胞瘤来源的胶质母细胞瘤25例、少突胶质细胞来源的胶质母细胞瘤15例。其中，不包含WHO Ⅰ级的星形细胞来源的肿瘤共80例，少突胶质细胞瘤35例，混合型少突-星形细胞瘤5例。也可根据2016年WHO胶质瘤诊断标准简单分为低级别胶质瘤(WHO Ⅰ级和WHO Ⅱ级)和高级别胶质瘤(WHO Ⅲ级和WHO Ⅳ级),各80例。所有病例中男111例，女69例；年龄21～78岁，中位年龄58岁。所有病例均为初诊患者，均无严重并发症，无基础性代谢性疾病，均为初诊患者，术前未行放化疗及靶向治疗，常规病理取材，10%中性缓冲福尔马林固定液固定6～8 h, 常规脱水处理及石蜡切片，所选取的蜡块均包含肿瘤旁正常脑组织。本实验通过广东祈福医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法

免疫组织化学法试剂HSP70和S100A9均购自Abcam公司，均为兔抗人多克隆抗体，工作浓度均为1∶50,所选蜡块以4 μm厚度常规切片，涂胶片捞片，脱蜡，采用微波修复抗原，检测方法严格按照试剂盒所附操作说明书的步骤进行。采用缩短一抗/二抗孵育时间，并多次以不同抗体浓度、多次预实验等以选择最合适的工作浓度及实验方法，进而大规模染片、判读、打分及统计分析。

1.2.2 免疫组织化学法结果判读

由2位副主任医师各自独立观察判断，2个免疫标记均以细胞核和(或)细胞质出现棕黄色颗粒着色为阳性细胞，从正常着色细胞、着色位置、内对照及外对照等综合判断染片质量，排除非特异染色干扰。选取5～10高倍镜视野(400倍),计数500～1 000个细胞。采用二级计分法判定结果，阳性细胞数低于5%为0分；5%～25%为1分；>25%～50%为2分；>50%～75%为3分；>75%为4分。染色强度分类：淡黄色为1分；黄色或深黄色为2分；褐色或棕黄色为3分。两者相加低于2分为阴性(-);2～3分为阳性(+);4～5分为中等阳性(++);6～7分为强阳性(+++)。

1.3 统计学处理

应用SPSS25.0软件进行数据处理，计数资料以率或构成比表示，采用κ系数检验及χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 HSP70和S100A9在胶质瘤组织中的表达

HSP70主要表达于肿瘤细胞的胞质，偶尔表达于细胞膜和细胞核；正常人体组织较少表达HSP70。免疫组织化学染色结果显示，HSP70在胶质瘤组表达阳性率为85.0%(136/160),在正常脑组织表达阳性率为23.1%(37/160),二者比较，差异有统计学意义(P<0.05)。S100A9在大部分肿瘤细胞阴性表达，主要表达于反应性或出血灶中的中性粒细胞、巨噬细胞的细胞核，部分细胞质也有表达。S100A9在胶质瘤组表达阳性率为7.5%(12/160),在正常脑组织组表达阳性率为4.4%(7/160),二者比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表1。

2.2 HSP70和S100A9在不同级别胶质瘤组织中的表达阳性率比较

HSP70在WHO分级Ⅰ～Ⅳ级胶质瘤组织中的表达阳性率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。S100A9在WHO分级Ⅰ～Ⅳ级胶质瘤组织中的表达阳性率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3 HSP70和S100A9在低级别胶质瘤与DNT组织中的表达阳性率比较

HSP70在低级别胶质瘤组表达阳性率显著高于DNT组，差异有统计学意义(P<0.05);S100A9在DNT组与低级别胶质瘤组表达阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05),无鉴别诊断意义。见表3。

图1 胶质瘤组织中HSP70和S100A9的典型阳性表现(免疫组织化学染色法,200×)

表1 HSP70和S100A9在胶质瘤组织中的表达

表2 HSP70和S100A9在不同WHO分级胶质瘤组织中的表达差异[n(%)]

表3 胶质瘤组与DNT组HSP70、S100A9表达阳性率比较[n(%)]

2.4 胶质瘤组织中HSP70和S100A9表达的相关性分析

通过配对计数资料的κ系数检验，因为κ<0.4,可见HSP70和S100A9在脑胶质瘤组织中的表达无相关性。

3、讨论

HSP70是HSP家族的重要成员，主要作用是调控人体应急状态下的蛋白质代谢水平，其表达水平与细胞的应激能力及功能状态密切相关，也可在一定程度上反映细胞的老化程度[4]。在肿瘤患者中，不同分化程度和不同分期的肿瘤细胞中HSP70表达水平均有不同，部分研究发现继发性耐药的肿瘤患者HSP70表达水平升高[5]。也有研究认为HSP70可能诱导和增强人体自主的抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤细胞生长。如，HSP70参与了肿瘤细胞表型改变及与肿瘤特异性多肽抗原结合形成免疫复合物，诱导机体免疫系统识别肿瘤细胞，引发人体的抗肿瘤特异免疫反应；HSP70也可以间接或直接激活自然杀伤细胞(NK细胞),直接杀灭肿瘤细胞[6,7]。近年来，已发现在多种肿瘤中HSP70高表达，如胶质瘤[7]、肝细胞癌[8]、乳腺癌[9]、胃癌[10]、肺腺癌[11]等。

本实验研究结果表明，HSP70的表达在胶质瘤与正常脑组织之间有显著差异，且随着胶质瘤WHO级别的增加其表达水平升高，说明HSP70与胶质瘤的分化程度有密切关系，可用于胶质瘤的辅助诊断标志。HSP70还可作为胶质瘤的潜在治疗靶点，如抑制HSP70的合成或阻断其抗凋亡作用均可延长胶质瘤患者的生存期。DNT分为复杂型和单纯型，典型的星形细胞瘤与单纯型DNT有比较好分辨的形态学特征，而复杂型DNT由于具有特殊的少突胶质细胞样细胞，与少突胶质细胞瘤鉴别十分困难。本实验结果表明，HSP70在DNT与低级别胶质瘤组织中的表达有统计学差异，少突胶质细胞瘤表达明显升高，可用于两者的辅助鉴别诊断，从而避免将复杂型DNT诊断为WHO Ⅱ级的少突胶质细胞瘤，继而导致不必要的过度治疗，加重患者负担且浪费医疗资源。本实验设计没有验证HSP70与Ki-67等现有胶质瘤免疫标记的相关性，也无证据表明与已有的胶质瘤免疫组织化学指标有相关性。

S100A9蛋白属于钙结合蛋白，其编码基因位于染色体1q21区，易发生重排、易位、缺失等改变，主要参与细胞的分化和增殖，以及部分蛋白磷酸化，也参与一些具有突变的肿瘤细胞的侵袭和转移[12]。已有研究发现，S100A9蛋白在肺癌[13]、鼻咽癌[14]、宫颈癌[15]、乳腺癌[16]、胃癌[17]等诸多肿瘤中表达升高，且S100A9表达阳性率与肿瘤的分化程度呈负相关，可能与肿瘤的发展、增殖、侵袭及转移相关。

本实验结果表明，S100A9在大多数胶质瘤细胞中无表达，仅少许肿瘤细胞弱表达，而在肿瘤组织中出血灶表达增高，且主要表达于出血灶中的中性粒细胞、巨噬细胞，部分淋巴细胞也有表达，这与大多数文献研究不同，作者仔细研读相关文献，发现很多文献中的配图也是表达于中性粒细胞及淋巴细胞，并不是表达于肿瘤细胞，作者在180例免疫组织化学中观察到了这个现象，其原因尚不清楚。因此S100A9不能作为胶质瘤的辅助诊断标志物，不能用于判断胶质瘤的预后，与胶质瘤的发生发展关系不明，也不能用于低级别胶质瘤与DNT的鉴别诊断。鉴于S100A9主要表达于中性粒细胞、巨噬细胞及部分淋巴细胞，提示可用于肿瘤免疫微环境的监测，但其具体临床意义则需要大量的临床实验数据验证才可得出结论。

参考文献:

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