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ILF2通过调控线粒体内稳态促进非小细胞肺癌体内外细胞增殖

2024-03-13 155 上传者：管理员

摘要：目的:探讨白介素增强子结合因子2(interleukin enhancer binding factor 2,ILF2)在非小细胞肺癌细胞增殖中的作用并探讨其机制。方法:选取来自某医院2016年3月至2022年6月间非小细胞肺癌患者癌及癌旁组织各15例，采用shRNA方法抑制非小细胞肺癌A549和H1299细胞系中ILF2表达，通过qRT-PCR、免疫组化和Western blot方法检测组织和细胞中ILF2的mRNA和蛋白表达，采用克隆形成和BrdU方法分析A549和H1299细胞体外增殖，无胸腺小鼠经皮下注射A549细胞后通过免疫组化技术观察Ki67和活化caspase 3(cleaved caspase 3)的表达，通过分析A549和H1299细胞中线粒体DNA(mtDNA)、线粒体质量和线粒体膜电位观察线粒内稳态。结果:与癌旁组相比，肺癌组织中ILF2的mRNA和蛋白表达均显著上调(P均<0.05);抑制ILF2表达可降低A549和H1299细胞体外克隆形成和增殖能力以及A549细胞在小鼠体内肺癌细胞生长能力(P均<0.05),小鼠肺组织中Ki67表达显著降低(P<0.05),A549和H1299细胞中mtDNA和线粒体质量均显著降低，线粒体膜电位显著上调(P均<0.05);过表达ILF2可促进A549和H1299细胞中体外克隆形成和增殖能力以及mtDNA和线粒体质量，降低线粒体膜电位(P均<0.05)。结论:ILF2在非小细胞肺癌进展过程中发挥重要作用，可能与破坏线粒体内稳态有关。

关键词：
NSCLC
白介素增强子结合因子2
线粒体内稳态
肺癌
非小细胞肺癌
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非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是一种恶性程度较高的肺癌，具有早期转移、快速增长、复发率高等特征[1]。现有靶向药物对于改善NSCLC患者的生存期有一定意义，但由于NSCLC多存在一线治疗后复发和(或)转移且预后不良的现象，早诊断、早治疗以及对预后的准确判断是治疗并延长NSCLC患者生存时间的关键[2]。因此，寻找新的NSCLC驱动基因和治疗靶点具有重要意义。

白介素增强子结合因子2(interleukin enhancer binding factor 2,ILF2)是调控T细胞特异性表达白细胞介素2(interleukin 2,IL-2)的重要转录因子[3]。最近研究表明ILF2在肝癌、小细胞肺癌、胰腺癌和胃癌等多种恶性肿瘤中异常表达[4,5,6,7]。本课题组已证实ILF2在NSCLC中高表达，但是其在NSCLC进展中的角色尚不清楚。本研究拟通过体内外实验，探讨ILF2对NSCLC细胞增殖的影响并探讨其机制。

1、材料和方法

1.1 标本来源

选取2016年3月至2022年6月某医院收治并经病理学确诊的NSCLC患者共15例。其中男性患者9例，女性患者6例；年龄39至73岁，中位年龄54岁；病理分级Ⅰ级5例，Ⅱ级4例，Ⅲ级6例。所有患者均为初治，手术标本为肿瘤的核心区域和同一患者的正常肺组织区域，组织切除后立即存放于液氮保存。所有患者均签署知情同意书，实验流程符合伦理委员会要求。

1.2 慢病毒感染及稳定细胞系筛选

人NSCLC A549和H1299细胞购买自中国科学院细胞库，以含有10%胎牛血清的F-12K培养基培养A549细胞，RPMI 1640培养H1299细胞，于37 ℃,5%CO2孵箱培养。ILF2-shRNA和慢病毒空载体购自上海吉玛制药技术有限公司，ILF2-shRNA1靶序列为 5'-CCACAGTTAAAGTTCTCATAA-3',ILF2-shRNA2靶序列为5'-GCTATCTTGCTTCTGAAATAT-3'。将A549和H1299细胞(均2×105)接种在 6孔板中，过夜后更换含8 μg/mL聚凝胺的F-12K或RPMI 1640完全培养基以及ILF2表达质粒、ILF2-shRNA和慢病毒空载体，12 h后更换为不含聚凝胺的F-12K或RPMI 1640完全培养基，37 ℃继续培养72 h后加嘌呤霉素(1 μg/mL),筛选1周后经稀释获得单细胞悬浮液，培养ILF2沉默和过表达A549和H1299细胞系进行后续实验。

1.3 Western blot实验

将细胞裂解后经4 ℃条件13 000 r/min离心10 min取上清获得总蛋白。蛋白样品通过10%SDS-PAGE分离，转至PVDF膜，置于5%脱脂牛奶，室温封闭2 h, 置于含ILF2抗体(美国Santa Cruz公司，1∶1 500)和β-actin抗体(美国Sigma公司，1∶5 000)的5%脱脂牛奶中，4 ℃过夜。将膜置于TBST溶液中，漂洗后置于含HRP-二抗(美国Sigma公司，1∶2 000)的5%脱脂牛奶中室温孵育1.5 h。将膜置于TBST溶液中漂洗，通过蛋白印迹HRP化学发光检测试剂(美国Millipore公司)和Tanon 6200发光成像工作站(上海天能科技有限公司)进行成像化处理。β-actin作为内参。

1.4 qRT-PCR实验

肺组织经匀浆器研磨或细胞经消化离心后，Trizol法提取总RNA,应用7500 Real-Time PCR仪(美国Applied Biosystems公司)通过逆转录试剂盒进行逆转录得到cDNA并取得Ct值，采用2-△△Ct法分析各个样品的基因相对表达差异。GAPDH作为内参基因。PCR引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.5 细胞克隆形成实验

将A549和H1299细胞经F-12K或RPMI 1640完全培养基37 ℃、5%CO2孵箱培养7天后，弃去上清液并用PBS洗涤2次后，加甲醇固定15 min, 去掉固定液后经Giemsa染色30 min, 洗涤并空气干燥后通过显微镜观察克隆形成情况。

1.6 细胞增殖实验

将A549和H1299细胞于96孔板中经F-12K或RPMI 1640完全培养基37 ℃、5%CO2孵箱培养24 h后，使用人溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)ELISA试剂盒(美国罗氏应用科学部)按照说明书方法经酶标仪检测荧光强度变化。

1.7 动物实验

4～6周龄雌性无胸腺小鼠购自中国人民解放军军事医学科学院，将A549-scramble或A549-shILF2-1细胞(5×106/只)在小鼠背部行皮下注射，3周后处死小鼠，取肺组织进行后续研究。

1.8 免疫组化实验

人或小鼠肺组织经过10%多聚甲醛固定后，通过组织芯片方法(美国US Biomax公司)经过苏木精-伊红染色、小鼠Ki67抗体(美国Abcam公司)、小鼠cleaved caspase 3抗体(美国Cell Signaling公司)、人ILF2抗体(美国Santa Cruz公司)孵育进行免疫组化分析。

1.9 线粒体质量分析

通过总DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取A549和H1299细胞中总RNA,使用LightCycler® 96实时荧光定量PCR仪(美国罗氏诊断产品有限公司)检测线粒体DNA(mtDNA)拷贝数，采用2-△△Ct法分析相对表达差异。Mt-Mito上游引物序列： 5'-CACTTTCCACACAGACATCA-3',下游引物序列：5'-TGGTTAGGCTGGTGTTAGGG-3';B2M 上游引物序列：5'-TGTTCCTGCTGGGTAGCTCT-3',下游引物序列：5'-CCTCCATGATGCTGCTTACA-3'。细胞经100 nmol/L线粒体红色荧光探针(美国Invitrogen公司)37 ℃条件下室温避光孵育15 min, 通过流式细胞仪检测荧光强度分析线粒体质量。

1.10 线粒体膜电位分析

A549和H1299细胞经10 μg/mL JC-1荧光探针在37 ℃条件下室温避光孵育10 min, 通过流式细胞仪检测荧光强度分析线粒体膜电位变化。

1.11 统计学分析

采用SPSS 11.0 软件，正态分布数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单向方差分析(One-way ANOVA),组间多重比较采用LSD-t检验，以P<0.05代表差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 ILF2在NSCLC患者肺组织中的表达

通过免疫组化和qRT-PCR实验发现，与癌旁组相比，肺癌组织中ILF2的mRNA(I级组癌组织vs癌旁组织：2.35±0.81 vs 1.00±0.19;II级组癌组织vs癌旁组织：15.19±9.26 vs 1.00±0.13;III级组癌组织vs癌旁组织：21.08±16.40 vs 1.00±0.11)(P均<0.05)和蛋白表达均显著上调(图1),III级患者肺组织中ILF2表达高于I级和II级患者，II级患者肺组织中ILF2表达高于I级患者，但无显著性差异(表2)。

图1 ILF2在NSCLC组织及癌旁组织中蛋白的表达(免疫组织化学染色)

表2 ILF2在NSCLC患者肺组织中mRNA的表达

2.2 ILF2沉默及过表达肺癌细胞构建的验证

通过Western blot和qRT-PCR实验证实，经过ILF2-shRNA感染和ILF2过表达质粒感染后，A549和H1299细胞中ILF2蛋白和mRNA表达发生显著下调或上调，证实ILF2沉默及过表达肺癌A549和H1299细胞构建成功(图2,表3)。

2.3 ILF2对肺癌细胞体外克隆形成和增殖的影响

通过细胞克隆实验和增殖实验发现，下调ILF2表达可抑制A549和H1299细胞体外克隆形成和增殖能力，上调ILF2表达可促进A549和H1299细胞体外克隆形成和增殖能力(图3,表4-5)。

图2 ILF2在A549和H1299细胞中蛋白的表达

2.4 ILF2对肺癌细胞体内生长的影响

体内细胞增殖实验表明，抑制A549细胞中ILF2表达可降低肿瘤细胞体内增殖。与对照组(Scramble)相比，ILF2 shRNA组(shILF2-1)在小鼠体内成瘤的体积[(943±213)mm3 vs (583±116)mm3]和重量[(0.65±0.10)g vs (0.46±0.15)g]均显著下调(P<0.05)。通过分析Ki67和活化caspase 3(cleaved caspase 3)表达分别探讨肿瘤恶性程度和凋亡水平，结果表明ILF2 shRNA组小鼠肿瘤组织中Ki67表达显著下调(P<0.05),但活化caspase 3表达未见显著变化(图4),提示ILF2对肿瘤生长的调控作用可能与死亡受体途径无关。

表3 ILF2在A549和H1299细胞中mRNA的表达

2.5 ILF2对肺癌细胞线粒体内稳态的影响

线粒体质量和膜电位对线粒体内稳态具有重要意义，通过线粒体质量和膜电位分析发现，抑制ILF2表达可显著下调A549和H1299细胞mtDNA水平和线粒体质量，显著上调JC-1荧光强度(即线粒体膜电位上调),而过表达ILF2表达可显著上调A549和H1299细胞mtDNA水平和线粒体质量，显著下调JC-1荧光强度(即线粒体膜电位下调)(表6-8)。

3、讨论

NSCLC是一种恶性程度极高的肿瘤，由于其异质性强，患者生存差异大，术后易局部复发和发生远处转移，需要探索新的NSCLC驱动基因和治疗靶标[8]。ILF2又称核因子45(nuclear factor 45,NF45),其编码蛋白属于活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NFAT)亚基，是一种序列特异性DNA结合蛋白，可通过抑制mRNA稳定性调控细胞生长，已经被证实参与小细胞肺癌、肝癌、胃癌等多种肿瘤体外生长和肿瘤进展，但是ILF2在NSCLC中的角色还尚未明确。

图3 ILF2对肺癌细胞体外克隆形成的影响

表4 ILF2对A549和H1299细胞体外克隆形成的影响

表5 ILF2对A549和H1299细胞体外增殖的影响

图4 ILF2对肺癌细胞体内肿瘤相关基因表达的影响

表6 ILF2对A549和H1299细胞mtDNA相对表达的影响

在本研究中，我们观察到与癌旁组织相比，NSCLC组织中ILF2高表达并与NSCLC患者病理分级相关。此外，ILF2在体内和体外实验中均可促进NSCLC肿瘤生长，表明ILF2中NSCLC进展过程中发挥癌基因作用。本研究还发现，沉默ILF2表达后小鼠肿瘤组织中Ki67表达显著下调，证实ILF2可调控NSCLC体内增殖活性和恶性程度，但是活化caspase 3表达未见显著变化，提示ILF2对肿瘤生长可能存在死亡受体途径以外的调控机制。

线粒体在有氧呼吸、物质代谢、氧化应激、凋亡、Ca2+稳态等方面发挥重要功能。线粒体内稳态对于维持正常的线粒体功能和细胞生长起着重要的作用，线粒体功能异常可导致肿瘤发生[9,10]。线粒体DNA(mtDNA)是线粒体内独立于细胞核的遗传物质，为了适应肿瘤细胞快速分裂的需要，通过不断转录以产生新的线粒体，被认为是重要肿瘤生长原料和治疗靶点[11]。随着细胞内线粒体的过度增多，线粒体及其蛋白的稳态调节能力下降影响了正常的线粒体功能，导致正常细胞的恶性转化[12]。已有研究证实，抑制mtDNA转录可下调肿瘤细胞体外增殖及小鼠模型的肿瘤体积[13]。线粒体质量(mitochondrial mass, MM)和线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)均是评价线粒体功能的重要指标，线粒体功能受损可诱导线粒体代偿性合成导致线粒体质量升高，正常线粒体内外膜之间维持着较高电位差，线粒体功能受损导致质子梯度下降，MMP会随之降低，因此二者可反映线粒体功能的完整性以及细胞的健康状况，监测细胞恶性转化风险[14,15,16]。

表7 ILF2对A549和H1299细胞线粒体质量的影响

表8 ILF2对A549和H1299细胞JC-1荧光强度的影响

在本研究中，我们还发现ILF2可在转录水平调节线粒体功能，抑制ILF2表达可显著下调A549和H1299细胞mtDNA水平和线粒体质量，显著上调线粒体膜电位，反之过表达ILF2可显著上调细胞mtDNA水平和线粒体质量，显著下调线粒体膜电位。

本研究通过一系列实验证实了ILF2在NSCLC中高表达，下调ILF2表达后NSCLC细胞增殖能力显著减弱，而上调ILF2表达可促进NSCLC细胞增殖，但其机制可能与死亡受体途径调控无关。ILF2对线粒体功能的影响说明其在NSCLC进展过程中发挥的生物学功能可能与破坏线粒体内稳态有关。

参考文献:

[10]徐冰洁,何昌龙,赵静,等.线粒体功能紊乱与肿瘤[J].现代肿瘤医学,2018,26(05):772-776.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(编号:81602026);天津市临床重点学科(专科)建设项目(编号:TJYXZDXK-047A);

文章来源:贺丽华,赵猛,刘树业等.ILF2通过调控线粒体内稳态促进非小细胞肺癌体内外细胞增殖[J].现代肿瘤医学,2024,32(08):1387-1392.