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多巴胺改性水凝胶荷载顺铂抑制KRAS突变肺癌细胞增殖的研究

2024-06-21 41 上传者：管理员

摘要：目的:观察荷载顺铂的多巴胺改性水凝胶对KRAS突变肺癌细胞增殖的影响。方法:以聚乙烯吡咯烷酮(PVP)与壳聚糖为材料合成注射用水凝胶，化学交联法引入多巴胺形成多巴胺改性水凝胶；细胞共培养研究多巴胺改性水凝胶的溶胀性、生物安全性及载药释放能力；体外共培养研究多巴胺改性水凝胶荷载顺铂对KRAS突变肺癌细胞增殖的影响；裸鼠体内异种移植瘤研究多巴胺改性水凝胶荷载顺铂对移植瘤增殖的抑制作用。结果:多巴胺改性水凝胶具有很强的溶胀性、良好的生物安全性、强大的药物荷载释放能力及敏感的pH组织环境识别力，多巴胺改性水凝胶荷载顺铂给药较单独顺铂给药对体内外KRAS突变肺癌细胞的增殖均具有更强的抑制作用。结论:传统细胞毒药物与多巴胺改性水凝胶结合具有更强的抗肿瘤作用，可能为将来细胞毒药物抗肿瘤治疗提供新的给药模式。

关键词：
KRAS突变
多巴胺
水凝胶
肺癌
顺铂
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肺癌常见的腺癌病理类型中超过1/3伴有KRAS基因的突变，虽然新的抗肿瘤药物的不断问世，肺癌患者的生存期得到明显延长，但是以化疗为基础的肺癌治疗模式仍是目前全球的共识[1,2]。然而，目前细胞毒药物仍难确保肿瘤病灶组织中稳定的有效药物浓度，其多次注射细胞毒药物亦难以维持病灶中有效药物浓度，且其毒副作用增加也使其广泛应用受到一定限制[3,4,5]。

水凝胶是一种具有良好体内外生物相容性和高灵敏度的亲水性聚合物，已被广泛应用于食品封装、生物支架及药物荷载释放等研究领域[6,7,8]。既往研究表明，多巴胺的儿茶酚结构和水凝胶易被氧化成半醌结构，通过发生Michael加成或Schiff碱反应而增加其内聚吸附能力，可有效增强其荷载和释放细胞毒药物能力[9,10,11]。然而，长期水凝胶应用存在一定的组织损伤可能，如可能导致组织细胞通透性和脆性增加等[12,13,14]。因此，在与细胞毒药物联合时应尽量减少水凝胶的治疗时间，其既可保证肿瘤病灶组织中足够高的药物浓度，又能减少全身体循环的药物浓度，从而降低全身毒副作用[15,16,17]。

本文旨在研究多巴胺改性pH敏感水凝胶荷载顺铂对体内外KRAS突变肺癌细胞增殖的影响，以期为将来开展抗肿瘤治疗新方案提供科学的理论依据。

1、材料和方法

1.1 材料合成

1.1.1 水凝胶合成

将15 mL二级水、0.15 g壳聚糖及2 mL H+(3 mol/L)加入5 mL烧瓶中充分搅拌均匀，再加入0.13 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)搅拌后抽至真空，最后加入0.2 mL 37%的甲醛后，在室温下放置24小时。

1.1.2 多巴胺交联

将0.05 g多巴胺加入10 mL Tris-HCl溶液中(0.05 mol/L)搅拌溶解，再将预先合成的水凝胶加入其中，经室温浸泡48小时后过滤、干燥备用。

1.2 多巴胺改性水凝胶的溶胀性

将10 g冻干水凝胶浸入37 ℃的PBS(pH=7.35/5.5)中，每10分钟提取一次水凝胶称重，共进行80分钟(每个实验的独立样本量n=3)。溶胀率(%)=(Ws-Wd)/Wd×100%,其中Ws表示溶胀水凝胶的重量，Wd表示冻干水凝胶的初始重量。

1.3 多巴胺改性水凝胶的生物安全性

1.3.1 多巴胺改性水凝胶的溶血率

将制备好的1 mL红细胞液(细胞密度：4.5×107/mL)加入3.67 mL生理盐水中，重复3次以1 500 r/min离心15分钟来分离不含红细胞的上清液。将预先合成的四种水凝胶分别与1 mL生理盐水混合，完全溶解后将每种溶液的100 μL加入1 mL生理盐水中制成供试品溶液。将1 mL生理盐水作为阴性对照、1 mL去离子水为阳性对照。向每种供试品中加入100 μL制备的红细胞悬液，在37 ℃环境下培养1小时。以300 r/min离心15分钟后将每个样品加入96微孔板中，读数器在540 nm处计算结果。溶血率(%)=(At-An)/(Ap-An)×100%,其中At和Ap分别表示实验组和阳性对照组的光密度(optical density, OD)值，An表示阴性对照组的OD值。

1.3.2 多巴胺改性水凝胶的细胞毒性

分别将10 mL人脐静脉内皮细胞(HUVEC,细胞密度：1×105/mL)加入到含有10%FBS的RPMI1640培养基和DMEM培养基中，在37 ℃、5%CO2及95%湿度的环境下培养24小时后，再接种到96微孔板中。将同质量的四种水凝胶加入相应的培养基中过滤后灭菌，得到1 mg/mL的无菌母液后，将其加入到微孔板的每个孔中与细胞共培养1、3、5天。最后采用CCK-8(Focus Bioscience, Shanghai)法测定细胞活力，光密度(OD)分光光度计测定的细胞活力(%)=OD结果/OD对照×100%。

采用Calcein-AM/PI双染色剂对活死细胞进行染色，准备2 μmol的Calcein-AM溶液A和8 μmol的Calcein-PI溶液B。将5 μL 16 mmol溶液B原液加入10 mL PBS溶液中混合，得到8 μmol溶液B工作液；再将5 μL 4 mmol溶液A原液加入上一步制成的溶液B工作液中混合，得到的混合工作溶液即可直接用于活死细胞染色。最后，将混合工作溶液加入四种水凝胶细胞中培养0.5小时，用10 μL PBS液洗涤后，在发射波长490 nm的显微镜下观察。

1.4 多巴胺改性水凝胶的载药释放能力

将荷载顺铂(Cisplatin)的pH敏感水凝胶分别置于pH=7.35/5.5的两组10 mL PBS中持续释放16天，每2天抽取100 μL溶液滴入96微孔板中对结果进行量化处理，并在抽取后立即补充100 μL PBS实验溶液(每个实验的独立样本量n=3)。

1.5 多巴胺改性水凝胶的体外抑瘤作用

既往研究表明，Cisplatin可以有效抑制A549 KRAS突变肺癌细胞的增殖[18]。实验组包括2.5 μmol Cisplatin、10 μmol Cisplatin、多巴胺改性pH敏感水凝胶+2.5 μmol Cisplatin及多巴胺改性pH敏感水凝胶+10 μmol Cisplatin四组，将每组分别与A549 KRAS突变肺癌细胞进行体外共培养1、3、5天(每个样品中的细胞数为 8×106,每个实验的独立样本量n=3)。最后，采用流式细胞仪进行细胞凋亡的定量分析。

1.6 多巴胺改性水凝胶的裸鼠体内抑瘤作用

采用免疫功能低下的裸鼠进行异种移植研究，选取6只裸鼠在皮下分别接种A549 KRAS突变肺癌细胞，在形成可触及的肿瘤结节后，将裸鼠分为两个实验组(n=3):第一组，在裸鼠肿瘤部位注射5 μmol Cisplatin; 第二组，在裸鼠肿瘤部位注射多巴胺改性pH敏感水凝胶+5 μmol Cisplatin。此后每周三注射一次，期间每隔5天通过MRI测量裸鼠皮下肿瘤的最长径，并在第40天时解剖裸鼠，完整取出肿瘤结节进行比较。

1.7 统计学方法

通过SPSS 25.0对数据进行分析。采用单因素方差分析(ANOVA)和Tukey Kramer多重比较后检验确定体内实验的统计显著性；采用t检验对未配对的数据进行两组之间的比较，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 水凝胶材料合成

本研究以PVP和壳聚糖为基质通过化学交联合成了实验所需的水凝胶，其中多巴胺改性水凝胶呈特殊的棕色，与其他白色透明的水凝胶明显不同(图1A)。

2.2 水凝胶的溶胀性

在水凝胶的制作过程中，通过量化水凝胶完全固化所需的时间，结果表明多巴胺改性水凝胶的固化时间明显短于其他组，提示多巴胺改性水凝胶可能在肿瘤生长部位可更快凝固，减少肿瘤浸润和转移(图1B)。此外，水凝胶在人体生理(pH=7.35)环境下的溶胀性明显高于酸性(pH=5.5)环境，这表明酸性环境不利于水凝胶的溶胀(图1C)。

2.3 水凝胶的生物安全性

2.3.1 水凝胶的溶血率

四组水凝胶的溶血率测定，结果均低于5%,表明其具有良好的溶血生物安全性(图1D)。

2.3.2 水凝胶的细胞毒性

将水凝胶与人脐静脉内皮细胞共培养1、3、5天后，所有组的内皮细胞均存活良好，通过活死细胞染色量化结果表明各组的内皮细胞存活率均>90%,提示水凝胶具有良好的组织相容安全性(图2)。

图1 水凝胶表征

图2 生物安全性

2.4 改性水凝胶的载药释放能力

通过酶标检测仪连续16天测量PVP+壳聚糖+多巴胺+Cisplatin水凝胶不同pH值(pH=7.35/5.5)下药物释放量，并绘制成曲线，结果显示，酸性(pH=5.5)环境下Cisplatin药物的释放速率明显高于人体生理环境(pH=7.35),表明改性水凝胶在酸性的肿瘤组织微环境中具有更强的药物释放能力(最高达70%),而在人体正常组织中的药物释放能力较低(最高约40%)(图1E)。

2.5 改性水凝胶的体外抑瘤作用

各组A549细胞克隆形成图见图3A。体外共培养结果表明，在2.5 μmol及10 μmol的实验中，多巴胺改性水凝胶荷载Cisplatin给药较直接Cisplatin给药对体外A549 KRAS突变肺癌细胞的增殖作用均具有更强的抑制作用(图3B)。此外，在A549细胞克隆形成过程中发现，多巴胺改性水凝胶荷载药物组的克隆形成率明显低于直接给药组，进一步证明了改性水凝胶具有更强的肿瘤细胞增殖抑制作用(图3C)。

图3 体外抑瘤作用

2.6 改性水凝胶的裸鼠体内抑瘤作用

裸鼠皮下移植瘤研究结果显示，多巴胺改性水凝胶荷载5 μmol Cisplatin给药组肿瘤结节的大小明显小于直接5 μmol Cisplatin给药组(图4A-B)。连续监测肿瘤结节的大小绘制成生长曲线发现，多巴胺改性水凝胶荷载5 μmol Cisplatin给药组肿瘤的生长速率明显低于直接5 μmol Cisplatin给药组(图4C)。这表明改性水凝荷载Cisplatin给药在体内较Cisplatin直接给药具有更强的抗肿瘤细胞增殖作用。

图4 裸鼠体内抑瘤作用

3、讨论

非小细胞肺癌中KRAS突变率高达20%～30%,其中以KRAS-G12C突变最常见[19]。KRAS突变型肺癌为临床最不愿见到的，虽然KRAS靶点药物一直是临床研究的热点，但是目前仍没有专门针对KRAS突变的靶向药物问世[20]。此外，虽然免疫检查点抑制剂的出现为肺癌治疗开辟了新途径，但是目前在KRAS突变的晚期非小细胞肺癌中，尚缺乏大型Ⅲ期临床研究证明其具有确切的疗效[21]。因此，目前针对KRAS突变的晚期非小细胞肺癌患者常用的治疗方案仍以铂类为基础，联合培美曲塞、紫杉醇等一线细胞毒药物，并可联合抗血管生成类药物，然而治疗毒性是患者中断治疗的主要因素[22]。因此，在KRAS突变型晚期非小细胞肺癌靶向和免疫药物尚不可及的前提下，通过多巴胺改性水凝胶荷载细胞毒药物来提高治疗效果，并降低治疗毒性不失为可选的新给药模式。

认识到水凝胶具有强大的生物组织相容性后，其在生物医药领域的研究得到了更广泛的发展[23,24,25]。本研究成功合成了多巴胺改性pH敏感性水凝胶，并证明其具有很强的溶胀性、良好的生物安全性、强大的药物荷载释放能力及敏感的pH组织环境识别力。在体外KRAS基因突变型肺腺癌细胞研究中，证实了较直接顺铂注射给药，通过多巴胺改性水凝胶荷载顺铂给药的途径可更有效地抑制肿瘤细胞的增殖，减慢肿瘤细胞克隆性生长的速率。得益于改性水凝胶强大的药物荷载释放能力及敏感的pH组织环境识别力，在裸鼠体内实验中，证实了通过多巴胺改性水凝胶荷载顺铂给药的途径，可以显著增加以酸性环境为主的肿瘤病灶中的药物溶度，而外周组织中的药物溶度相对较低，表明其具有更强的抗肿瘤细胞增殖作用，并可能降低药物的外周毒性。此外，本研究发现多巴胺改性水凝胶具有更短的固化特性，其可能有利于促进肿瘤病灶的收缩固化，从而限制其向周围组织浸润和转移。

总之，多巴胺改性水凝胶具有很强的溶胀性、良好的生物安全性、强大的药物荷载释放能力及敏感的pH组织环境识别力，传统化疗药物与多巴胺改性水凝胶相结合具有更强的抗肿瘤细胞增殖作用，其可能为未来抗肿瘤治疗提供新的解决方案。

参考文献:

[2]董懂,黄意恒,张亚杰,等.《中华医学会肺癌临床诊疗指南(2023版)》解读[J].中国胸心血管外科临床杂志,2023,30(11):1533-1538

基金资助:2023年江西省卫生健康委科技计划项目(编号:202311199);

文章来源:刘智金,章健,甘琳,等.多巴胺改性水凝胶荷载顺铂抑制KRAS突变肺癌细胞增殖的研究[J].现代肿瘤医学,2024,32(14):2506-2511.