一氧化氮(NO)是一种理化性质十分活泼的气体小分子,具有调节动植物多种生理功能的作用[1,2].有研究表明,生物体在生长发育过程中也会产生少量NO[3].内源性的NO作为一种信使物质,能够起到调节生理功能的作用,作用特点类似于激素,即微量的NO具有参与或调节生物体生理功能的作用,过量的NO会对机体产生毒害作用[4].因此生物体已经进化出了一系列的机制以便及时高效地产生和清除NO.内源性NO的清除机制具有多样性的特点[5,6].NO的清除机制之一依赖于NO还原酶,还原酶还原NO为N2O.CYP55B1来源于莱茵衣藻,属于细胞色素P450大家族[7].它除具有P450酶的典型特性外,还能够实现NO的催化还原,该催化反应需要NADH提供电子[8,9,10].戊二醛是传感器研究领域十分常用的一种同型双功能交联剂,通过它的两个醛基分别与蛋白质或酶的氨基结合,形成酶/受体-戊二醛结合物[11].本研究基于CYP55B1催化特性,将CYP55B1和牛血清白蛋白混合,同时加入戊二醛进行交联反应,将混合物交联固定在热解石墨电极表面,构建酶生物传感器CYP55B1/GA/BSA/PGE,并成功的应用于NO的催化检测.

1、实验部分

1.1材料和仪器

大肠杆菌菌株DH5α、BL21(DE3)及原核表达载体pET-28a(+)、pET-28a-55b1均由中南民族大学生命科学学院生物医学分析团队提供.限制性内切酶EcoRI、HindIII(Takara公司);琼脂糖凝胶电泳Marker(东盛生物);蛋白质分子量Marker(Thermo);30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(摩尔比为29〯1)储备液、卡那霉素(上海生工);镍亲和纯化柱(康为世纪);异丙醇δ-氨基-γ-酮戊酸(ALA)和异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)购自AlfaAesar公司;其他试剂均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司;一氧化碳气体(CO)和氮气(N2,99%)购自武汉翔云公司,NO溶液参照文献[12]制备,制备得到的NO母液浓度为1.8mmol·L-1,避光密闭保存在带有橡皮塞的棕色玻璃瓶中.

电泳仪(北京六一仪器厂,DYY-6D);紫外-可见分光光度计(美国PerkinElmer,Lambda750);CHI660C电化学工作站(上海辰华仪器);标准三电极体系:CYP55B1/GA/BSA/修饰的热解石墨电极为工作电极,甘汞电极(SCE)为参比电极,铂丝为对电极.

1.2蛋白质的诱导表达与纯化

通过热激转化法将载体pET-28a(+)和pET-28a-55b1分别转化至大肠杆菌BL21(DE3),平板活化,挑取单菌落接种至5mL含有30μg·mL-1卡那霉素的LB培养基中,37℃,180r·min-1,培养12h,随后转接至50mLTB培养基(含有30μg·mL-1卡那霉素)中,37℃,180r·min-1,扩大培养2h,至OD值约为0.6,向培养基中加入终浓度为0.5mmol·L-1ALA、1mmol·L-1IPTG,28℃、160r·min-1培养22h.

4℃、3200g离心收集菌体,菌体置于冰上预冷后使其停止蛋白表达.加入6mLTris裂解液(pH值8.0,20mmol·L-1Tris-HCl+500mmol·L-1NaCl)重悬菌体,加入100μL溶菌酶(10mg·mL-1)冰上孵育40min,反复冻融3次,超声破碎菌体.4℃、13000g离心20min,收集上清液,过0.22μm滤膜后,过镍亲和柱纯化.冰上孵育结合1h后,依次用50、100、150、200、250mmol·L-1咪唑洗脱液(pH值8.0,含20mmol·L-1Tris-HCl、500mmol·L-1NaCl)梯度体积洗脱杂蛋白,并收集每一步的最后1mL流出液,最后5mL500mmol·L-1咪唑洗脱液洗脱目的蛋白,收集所有洗脱液,经超滤管浓缩,用于后续实验[13].

1.3细胞色素P45055B1的CO差示光谱测定

采用CO差示光谱法对CYP55B1进行定量分析[14].取5mL测定液和1mL的P450蛋白液样品混匀,加入100μL0.5mmol·L-1连二亚硫酸钠,混匀后于冰上静置1min,将上述溶液等量一分为二,分别加入到两个比色皿中,在400～500nm波长范围内扫描进行基线校准,向其中一个比色皿中缓慢的通入CO气体1min,冰上放置反应1min后,在400～500nm波长范围内扫描,得到还原型CYP55B1与CO形成复合物的紫外光谱.

1.4细胞色素P45055B1修饰热裂解石墨电极的制备

麂皮材料上添加少量0.05μm的氧化铝粉末,用二次蒸馏水浸润,热解石墨电极(PGE,直径3mm)于麂皮材料上顺时针方向抛光,无水乙醇中超声波清洗1次,二次蒸馏水中超声清洗2次,每次3min,室温晾干,取10μL修饰液[3μL2.5%戊二醛(GA)溶液、3μL2.5%牛血清白蛋白溶液(BSA)和4μLCYP55B1蛋白样品,混合均匀]滴涂在热解石墨电极表面,4℃交联固定过夜,得到CYP55B1修饰热裂解石墨电极(CYP55B1/GA/BSA/PGE).不含有CYP55B1修饰热裂解石墨电极(GA/BSA/PGE)作为对照.

1.5CYP55B1/GA/BSA/PGE检测NO

电解池中加入5mL0.1mol·L-1的PBS溶液(pH7.0),氮气除氧20min,保持氮气氛,将三支电极置于检测池,不断地加入NO溶液,磁力搅拌子混合均匀后,进行循环伏安(CV)扫描检测,扫速为0.5V/s.

1.6CYP55B1催化NO机理验证

向1.5中的溶液中不断加入NO溶液,直至该催化反应达到饱和状态后,向反应池中不断地加入母液浓度为1.8mmol·L-1的NADH溶液,磁力搅拌子混合均匀,进行循环伏安扫描.

1.7CYP55B1/GA/BSA/PGE的选择性

将修饰电极放入装有电解池中,加入5mL0.1mol·L-1的PBS溶液(pH7.0),通氮除氧20min,分别加入不同浓度的干扰物质谷胱甘肽(GSH)、氯化铵(NH4Cl)、亚硝酸钠(NaNO2)、L-精氨酸(L-Arg)、双氧水(H2O2),采用循环伏安法(CV)进行电化学检测,扫速为0.5V/s,重复试验3次.

2、结果与讨论

2.1蛋白纯化SDS-PAGE分析

对CYP55B1表达纯化各步骤样品进行SDS-PAGE分析,结果如图1所示:第1、2泳道是重组菌超声破碎离心的沉淀和上清液;第3泳道为镍柱流出液,可见待纯化样品与在镍亲和纯化柱冰上孵育结合后,由于杂蛋白与填料结合不牢固,直接流出;第4～9泳道是咪唑的梯度洗脱液,少数杂蛋白被梯度浓度咪唑缓冲液洗脱下来,最后经高浓度500mmol·L-1咪唑缓冲液洗脱得到纯度较高的目的蛋白,且其分子量大小48kDa,与理论预测的CYP55B1大小一致.实验结果表明:CYP55B1表达纯化成功,可用于后续的传感器的构建.

图1CYP55B1纯化的SDS-PAGE分析

M)Marker;1)诱导表达22h重组菌破碎离心沉淀;2)诱导表达22h重组菌破碎离心上清液;3)流出液;4～9)50、100、150、200、250、500mmol·L-1咪唑洗脱

2.2CYP55B1的CO差示光谱测定

重组菌样品破碎后4℃、10000g离心20min的上清液、沉淀以及500mmol·L-1咪唑洗脱液的样品进行CO差示光谱测定,结果如图2所示.测定各组分均具有P450特征性的紫外吸收峰,证明了CYP55B1成功诱导表达及纯化,且纯化后的蛋白样品仍具有活性.代入公式[13],计算得到纯化后CYP55B1的浓度为0.075nmol·L-1.

图2CYP55B1纯化CO差示光谱

2.3CYP55B1的直接电化学

在-1.2～0.1V范围内,扫速为0.5V/S,对CYP55B1修饰热裂解石墨电极进行循环伏安扫描.如图3所示:不含CYP55B1修饰热裂解石墨电极(GA/BSA/PGE),在扫描范围内,无任何氧化还原峰;而CYP55B1修饰热裂解石墨电极(GA/BSA/CYP55B1/PGE),有一对峰形较好的氧化还原电流峰,其氧化峰电位位于-0.355V,还原峰电位位于-0.385V,氧化还原峰电位差值ΔEp为30mV.结果表明:CYP55B1在热裂解石墨电极表面实现了直接电化学,其活性中心的卟啉铁与电极之间实现了直接电子传递,电位高于-0.355V,卟啉铁为+3价的氧化态,电位低于-0.385V,卟啉铁为+2价的还原态.

图3GA/BSA/PGE和GA/BSA/CYP55B1/PGE的循环伏安图

考察测定液pH值对CYP55B1直接电化学的影响,将修饰电极GA/BSA/CYP55B1/PGE置于不同pH值的0.1mol·L-1PBS溶液中,进行循环伏安扫描,结果如图3a所示.CYP55B1特征还原峰峰电位随着缓冲溶液pH值的改变而发生一定程度的迁移,由此得到图4b,即还原峰电位与缓冲液pH值的关系图,还原峰电位与缓冲液pH值成反比关系,缓冲液的pH值越高,还原峰电位越低.

2.4CYP55B1催化还原NO

CYP55B1修饰热裂解石墨电极放入PBS溶液,得到了其活性中心卟啉铁的氧化还原峰峰.不断地向测定池中加入NO溶液,磁力搅拌混合均匀后进行循环伏安扫描,结果如图5所示:随着NO的不断加入,-0.85V处的还原峰电流在不断升高,同时伴随-0.35V处还原峰电流不断降低,加入NO到一定浓度后,-0.85V处的还原峰电流和-0.35V处还原峰电流不再发生变化(2～11).NO与CYP55B1活性中心的卟啉铁的铁离子结合形成复合物,该复合物从电极得到一个电子,发生还原,还原峰电位位于-0.85V,同时由于卟啉铁的自由铁离子减少,-0.35V处还原峰电流不断降低.由于固定于电极表面的细胞色素P45055B1的量一定,所以加入一定浓度NO后,CYP55B1与NO的结合达到饱和,-0.85V处的还原峰电流和-0.35V处还原峰电流不再发生变化.

图4GA/BSA/CYP55B1/PGE在不同pH值的循环伏安曲图(a)CYP55B1还原峰电势与pH值线性关系图(b)

图5GA/BSA/CYP55B1/PGE对应不同NO浓度的循环伏安图

1～11:NO浓度分别为0、3.6、10.8、18、25.2、32.4、39.6、46.8、54、61.2、68.4μmol·L-1

如图6所示,NO的浓度在14.4～108μmol·L-1范围内,还原峰电流增大值与加入NO的浓度之间呈现线性关系,线性回归方程为:y=0.01696x-0.03447(R2=0.9766),检测限(LOD)为10.47μmol·L-1.

图6不同浓度NO与复合物电流差值的线性关系图

2.5CYP55B1/GA/BSA/PGE催化NO机理验证

CYP55B1修饰热裂解石墨电极放入PBS溶液,不断地向反应池中加入NO溶液,直至-0.85V与-0.35V处峰电流不再发生变化(1),此时CYP55B1与结合达到饱和,再依次向反应池中加入母液浓度为1.8mmol·L-1的NADH溶液,混合均匀后进行循环伏安扫描,结果如图7所示:随着溶液中NADH浓度不断地增大,-0.35V处还原峰电流在逐渐升高(2-11),表明在NADH不断提供电子的作用下,CYP55B1不断催化与其结合的NO还原为N2O,N2O离开CYP55B1的卟啉铁,自由的卟啉铁离子在电极表面发生还原,导致-0.35V处还原峰电流的不断升高,符合细胞色素P45055B1催化NO的还原反应机理.

图7CYP55B1/GA/BSA/PGE与不同浓度NADH溶液的循环伏安图

2.6CYP55B1/GA/BSA/PGE的选择性

选取谷胱甘肽、L-精氨酸、氯化铵、亚硝酸钠及双氧水5种物质来验证该检测方法的选择性.这几种物质在生物体内存在较普遍,在检测实际样品时可能会以干扰物质的形式存在,且谷胱甘肽和L-精氨酸可作为生物体合成NO的底物.在相同的实验条件下,加入干扰物质的浓度与NO的浓度相同,混合均匀后进行循环伏安扫描,重复3次.为了便于分析,选取NO、亚硝酸钠、双氧水、L-精氨酸、谷胱甘肽、氯化铵的浓度分别为18、36、54、72μmol·L-1时-0.85V处还原峰电流增加值进行对比,结果如图8所示.由图可知:浓度为18μmol·L-1时,其它物质的峰电流增加值均较低,相较之下,NO对应的峰电流增加值较大.浓度为36μmol·L-1时,谷胱甘肽、L-精氨酸、氯化铵的电流差值为负值,NO的峰电流持续增加了近一倍,且随着浓度的不断升高,峰电流在不断地上升,而其他物质对应的电流值并不具有规律性的变化.该结果表明,CYP55B1能在电极表面催化NO,但对其他常见含氮物质或强氧化物不具有催化活性,该检测技术具有特异性.

图8CYP55B1-BSA-GA修饰热解石墨电极的选择性

3、结语

本研究将构建成功的原核表达载体pET-28a-55b1通过热激转化法转化到大肠杆菌BL21(DE3),以β-半乳糖苷作为诱导剂,成功实现了CYP55B1的异源原核表达.通过超声破碎及镍亲和柱层析技术,对CYP55B1进行提取和纯化,最终得到了具有P450活性的CYP55B1.通过戊二醛和BSA共价交联技术将CYP55B1蛋白固定于热解石墨电极表面,利用CHI660电化学工作站,实现了NO的直接电化学检测以及CYP55B1催化NO的机理验证,并探讨了该检测方法的特异性.结果表明:CYP55B1具有P450nor的特性,能够催化NO的还原,且该催化反应需要NADH的参与,CYP55B1及其催化形成的复合物均具有电化学信号,能够实现NO的直接电化学检测.本研究利用这一催化反应机理,并基于酶促反应具有专一性强,灵敏度高的特点,开发了一种NO的检测技术,该检测技术只对NO具有响应,而对于一些在机体内产生NO的前体物质如谷胱甘肽不具有电化学响应.后续拟通过进一步探究和改进,有望将该检测技术应用到实际样品的检测,提高其实用性.

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基金:国家自然科学基金资助项目(31670372);中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(CZZ18004).