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安乃近含量mj定中碘-罗丹明B反荧光猝灭法的应用
摘要：碘液(I-3)对罗丹明B具有荧光猝灭作用,使荧光信号强度减弱甚至消失,而安乃近可将I-3还原为I-,使体系荧光信号再现。以360nm为激发波长,580nm作发射波长,测量试液荧光强度(F),根据F值与溶液中的安乃近浓度线性关系,完成安乃近反荧光测定。线性回归方程:y=51.85+9.531c(μmol/L),相关系数(r)=0.9970,线性范围为0～18μmol/L,检出限为3.1×10-9mol/L,方法相对标准偏差(RSD)为3.99%～4.04%。方法用于安乃近片剂以及安乃近注射液分析,测定值与药品标示量基本相符,加标回收率为97.0%～105.5%。
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安乃近(ALG)属于吡唑酮类解热镇痛药物,临床上广泛用于感冒、头痛、发热、肌肉关节痛、牙痛、痛经、风湿及类风湿关节痛等的治疗,但安乃近也存在一定的毒副作用,长期使用可引起粒细胞减少、再生障碍性贫血。目前,安乃近的测定方法主要有:碘量法[1]、高效液相色谱法[2,3]、电化学分析法[4]、分光光度法[5]、红外光谱法[6]、荧光分析法[7]和化学发光法[8,9]、显色光度法[10,11,12,13]等。文献[7]基于芳香族氨基酸荧光猝灭完成安乃近及其代谢产物含量测定,检出限为4×10-8mol/L。
罗丹明B(RB)具有荧光特性,其阳离子及I-3离子间借静电引力形成离子缔合物,可使其荧光消失,测定氧化性物质[14,15,16,17,18,19,20],但尚未见罗丹明B-I-3体系荧光再现用于还原性药物分析。在弱酸性条件下将碘溶液和罗丹明B混合瞬间即发生荧光猝灭,但在RB-I-3缔合物形成前加入安乃近,安乃近将I-3还原为I-,溶液重新发出荧光,其荧光强度(F)与安乃近浓度在一定范围内有线性关系,据此建立了一种安乃近反荧光猝灭测定方法。用本方法测定安乃近受样品浑浊度及色度影响很小,检测限为3.1×10-9mol/L[7]。
1、实验部分
1.1仪器与试剂
930N型荧光光度计,上海仪电分析仪器有限公司;分析天平(0.1mg),上海天平仪器厂;pHS-3C精密pH计,上海雷磁仪器厂。
罗丹明(RB,分析纯),天津市致远化学试剂有限公司;安乃近原料药,平凉药检所;安乃近片,山东新华制药股份有限公司;醋酸、醋酸钠,天津市盛奥化学试剂有限公司;碘标准溶液天津市盛奥化学试剂有限公司[21];水为二次蒸馏水。
1.2实验
1.2.1安乃近的工作曲线
在50mL容量瓶中分别准确加入1.0×10-4mol/L安乃近标准溶液0.00～10.00mL、1.0×10-3mol/L碘标准溶液2.00mL,摇匀,室温反应8min,依次加入10×10-4mol/L罗丹明B5.0mL,pH=4.7醋酸-醋酸钠缓冲溶液5.0mL,蒸馏水定容,静置10min后,以360nm作激发波长,580nm作发射波长,1.0×10-6mol/L罗丹明B作灵敏度调试液,测定其吸光度。以荧光强度(F)为纵坐标,安乃近浓度[c,(μmol/L)]为橫坐标绘制工作曲线,结果见图1。从图1可知,安乃近浓度在0～18μmol/L范围内与荧光强度(F)呈良好的线性关系:F=51.85+9.531c(μmol/L),相关系数(r)=0.9970。平行进行11次空白溶液的测定,计算标准偏差(S),根据检出限(DL)公式(1)计算得检出限为DL=3.1×10-9mol/L。
DL=3S/k(1)
图1安乃近的工作曲线
1.2.2安乃近片剂中质量浓度的测定
取市售安乃近片剂10片(500mg/片)研细,取500mg,置于100mL的容量瓶中,加水定容,摇匀,过滤,弃去初滤液,将续滤液稀释100倍,取稀释液2.50mL按1.2.1节方法测定安乃近质量浓度,结果见表1。从表1可知,对样品平行6次测定,平均值为406mg/片,测定值低于标示量(500mg/片),说明安乃近不稳定,在转移溶解过程中部分被空气氧化;但针对同一样品进行3次加标回收试验,回收率为97.00%～103.5%,表明方法具有较高的准确度。
1.2.3安乃近注射液中含量的测定
取兽用安乃近注射液1支(3g/10mL),取1.00mL,置于100mL的容量瓶中,加水定容(简称:一次稀释液),取一次稀释液1.00mL稀释到100mL(简称:二次稀释液)。取二次稀释液5.00mL按1.2.1节方法测定安乃近质量浓度,结果见表2。从表2可知,平行6次测定仍然保持较高的精密度,本法测定的平均值和标示量与药典法测定的结果基本一致,表明本法可用于安乃近制剂的含量检测。
表1安乃近片剂测定结果
表2安乃近注射液测定结果
2、结果与讨论
2.1荧光光谱
不同体系荧光光谱见图2。从图2可以看出,当λex为360nm时,罗丹明B在580nm处有一最大荧光峰,加碘液后荧光猝灭,荧光强度(F)减为原来的四分之一,但峰位未发生改变,说明罗丹明B和碘发生了缔合;在RB-I-3体系形成之前加入安乃近,荧光得以重现,且荧光强度(F)与安乃近加入量有关联。
图2荧光光谱
2.2罗丹明B用量的影响
按1.2.1节条件,考察了1.0×10-4mol/L罗丹明B加入量对荧光强度(F)的影响(图3)[22],从图3可知,当罗丹明B加入量为6mL后(罗丹明B的浓度≥1.5×10-5mol/L),会形成二聚体或多聚体,激发和发射波长逐渐红移,自熄灭作用增强,线性度消失。为了保证样品测定有足够宽度的线性范围和更低的检测限,选择最佳的1.0×10-4mol/L罗丹明B溶液的加入量为5.0mL(罗丹明B浓度为1.0×10-5mol/L)。
图3罗丹明B用量
2.3碘液用量的影响
按1.2.1节条件,在不含安乃近改变碘液用量的条件下,考察了罗丹明B荧光猝灭程度(图4)。从图4可知,随着碘量增加,罗丹明B的荧光强度(F)逐渐降低,在0～2mL范围内,线性度较好;当碘液加入量增加到4mL时,罗丹明B的荧光强度(F)开始呈现平缓趋势;当增加到6mL时,罗丹明B的荧光强度(F)几乎不再发生变化。因此,选择最佳的碘液量为2mL。
图4碘液用量对荧光强度(F)的影响
2.4酸度对荧光强度(F)的影响
取1.00×10-4mol/L安乃近标准液4.00mL,其他按1.2.1节条件,在溶液中加入不同体积的0.1mol/LHCl和0.1mol/LNaOH溶液,考察了溶液酸度对荧光强度(F)的影响(图5)[20]20]。从图5可知,随着pH的增加,游离态RB的羧基开始电离[22]22],并且电离程度逐渐增大,吸电子能力逐渐减弱,F值逐渐增大;pH=4.0～8.0时荧光强度(F)保持一个恒定状态;当体系的pH>9.0时,缔合物中的碘发生歧化[23]23],荧光强度(F)开始二次增大,说明pH在4.0～8.0时,比较适合RB和I-3缔合[24]24],也有利于安乃近氧化。因此,选择最佳反应介质为pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲溶液。
图5酸度对荧光强度(F)的影响
cALG=8×10-6mol/L
2.5反应温度与时间对荧光强度(F)的影响
取1.00×10-4mol/L安乃近标准液4.00mL,其他按1.2.1节条件进行实验,考察了反应温度与反应时间对荧光强度(F)的影响(图6～图7)。
图6反应温度对荧光强度(F)的影响
cALG=8×10-6mol/L
从图6可知,反应温度在20～35℃时,对荧光强度(F)的影响较大且变化较小。因此,选择最佳温度为25℃。
从图7可知,安乃近与碘反应速度较快,加入后黄色瞬间有变化,当6min时,F达到恒定(图7,曲线1);在室温下,罗丹明B与I-3在8min内反应完全(图7,曲线2)。因此,选择最佳的氧化时间为8min,最佳的荧光猝灭时间为10min。
图7反应时间对荧光强度(F)的影响
1—安乃近氧化；2—罗丹明B缔合cALG=8×10-6mol/L
2.6试剂加入顺序对荧光强度(F)的影响
取1.0×10-4mol/L安乃近标准溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00mL,其他按1.2.1节条件,考察了试剂加入顺序对荧光强度(F)的影响(图8)。从图8可知,ALG+I-3+RB顺序加入时有很好的线性度(图8,曲线2),而在缔合物形成后加入安乃近,荧光强度(F)变化不明显(图8,曲线1)。说明I-3与安乃近、缔合物RB-I-3与安乃近反应速度有差异,因此,选择最佳的加入顺序为ALG-I-3-RB。
图8试剂加入顺序对荧光强度(F)的影响
1—ALG-I-3-RB;2—ALG-I-3-RB-ALG
2.7共存物干扰试验
在1.2.1节条件下,考察了葡萄糖、糊精、乳糖、硬脂酸以及Ca2+,Mg2+,Al3+等阳离子干扰的影响(表3)。从表3可以看出,测定误差≤±5%时,50倍的葡萄糖、糊精、乳糖、硬脂酸及100倍的各种金属阳离子对测定结果均无干扰。
表3共存物干扰试验
1—葡萄糖;2—糊精;3—乳糖;4—硬脂酸;5—Ca2+;6—Mg2+;7—Al3+。
3、结论
本文基于碘-罗丹明B复合型荧光探针构建反荧光猝灭法测定安乃近含量新体系,优化了反应条件,在最佳条件下,线性方程y=51.85+9.531c(μmol/L)。方法简单实用,灵敏度性高,检出限为3.1×10-9mol/L。方法用于药剂样品中青霉素的测定,结果满意。
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基金:2019年度甘肃省高等学校创新能力提升立项(No.2019A-159,019B-202)资助项目.
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期刊名称：化学通报
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主管单位：中国科学院
主办单位：中国科学院化学研究所,中国化学会
出版地方：北京
专业分类：化学
国际刊号：0441-3776
国内刊号：11-1804/O6
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2020-09-09
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