DNA除了双螺旋结构外，还存在一些二级结构，比如发夹结构、i-基元结构及鸟嘌呤-四联体（G-四联体）构象[1,2]，而人体的一些生理过程，比如细胞增殖、发育、凋亡和肿瘤形成等都与G-四联体的形成有关[3,4]。G-四联体是由富含鸟嘌呤的序列形成的核酸结构，其结构组成单元是四个鸟嘌呤通过Hoogsteen氢键连接而成的G-四分体，两个或三个G-四分体通过π-π堆叠构成G-四联体[5]。它在人体多个重要生物功能区普遍存在。许多相关研究已经探讨了G-四联体结构与细胞衰老和癌细胞增殖的关系[3,6]。将G-四联体作为治疗靶标引起了极大的关注[7,8]。在人体端粒末端、癌基因启动区域及蛋白开关调控区富含鸟嘌呤的基因序列，在生理条件下可折叠成G-四联体，它会抑制基因转录和表达以及端粒酶的活性[9]。因此G-四联体的形成对人类寿命及癌细胞增殖控制有重要影响，研究并检测人体内G-四联体的成因与数量对个性化诊疗尤为重要。

端粒是真核生物染色体线性DNA分子3′末端的一段富含鸟嘌呤的DNA重复序列，维持着染色体稳定性。该重复序列的G链悬突形成的特殊结构可以使几条链的G残基相互连接起来[10]，形成G-四联体。当端粒序列DNA形成G-四联体后，它在不同的金属离子电导液中形成的二级结构的构象也是不同的，如双重重复人体端粒d(TAGGGTTAGGGT）序列[11]。在高浓度锂离子（Li+）电导液中会形成螺旋桨四联体结构[12]，在高浓度钠离子（Na+）电导液中形成篮筐结构[13]，而在高浓度钾离子（K+）电导液中则形成平行与反平行两种构型[14,15]。由于端粒的这种独特序列可能与其功能密切相关，因此近年来对端粒序列DNA空间结构的研究逐渐深入[16]。

传统的用于检测G-四联体结构的手段包括紫外光谱[17]、圆二色向谱[18]、核磁共振谱[19]、X射线衍射[20,21]、凝胶电泳法、热变性及表面等离子体共振等[22]，这些检测手段大都是表征序列折叠形成G-四联体以后的结构，无法实现单分子水平实时监测G-四联体的形成过程及构象变化，也无从得知G-四联体的形成诱因，且灵敏度不高。之后发展了一些如单分子荧光、光镊[23,24]等技术，但仍存在操作繁琐、费时、成本高等问题，而纳米孔单分子技术则为研究四联体复杂构象提供了一种新方法。纳米孔研究G-四联体结构形成机制主要有两个方向，即生物纳米孔和固态纳米孔。生物纳米孔是天然形成的孔，生物相容性好，固定的孔径和孔型保证了良好的实验可重现性，背景噪声小，但是其缺点为支撑孔的脂质层脆弱且孔径不可控。例如α-血溶素七聚体，其孔径最小处仅1.4nm[25]。固态纳米孔是人工加工的孔，孔径可控，可以根据检测物的大小来制备尺度匹配的纳米孔，从而提高检测的信噪比。J.W.Shim实验组[26]用α-血溶素七聚体这种蛋白质孔，在电压的驱动下，使可以形成G-四联体的端粒序列DNA在含有不同离子的电导液中通过蛋白质孔，从而产生过孔电信号，且通过对比不同种类的电导液中产生的过孔电信号持续时间和幅值，来分析四联体形成的差异。中国科学院L.Jiang实验组[27]在聚合物PET做成的小孔壁上连接可形成G-四联体的端粒序列DNA，通过改变pH值控制反应体系，从而使得四联体可逆地形成与解开；在K+环境下调节pH值来调控G-四联体DNA修饰的纳米通道的开合[28]。对于利用生物孔研究G-四联体，因为孔径的限制只能观测到G-四联体结构解开后的过孔信号，不能监测到完整结构过孔，微流道器件也只能监测G-四联体是否形成，不能比较G-四联体不同结构的差异。本文提出一种在限域空间内[29]，动态监测人体端粒序列DNA在金属离子诱导下形成G-四联体的方法，将端粒序列DNA共价固定在纳米孔内，在不同金属离子诱导下形成不同构象的G-四联体，通过分析其引起的离子堵塞电流信号来监测G-四联体结构。

1、纳米孔单分子分析技术

纳米孔单分子分析技术是通过外加驱动力使分子通过纳米孔，监测分子过孔或在孔内结构变化时产生的离子电流变化。固态纳米孔检测原理是在由绝缘材料薄膜分开的两个腔室中充满电导液，在绝缘薄膜上通过离子束或电子束轰击以及电流脉冲击穿等加工方式制备出纳米级别的小孔，利用电压驱动单个分子穿过纳米量级的孔道。由于待测分子通过这个孔道或者结构发生变化时产生物理占位，导致通过孔道的离子数量变化，从而引起离子电流的波动。通过采集分析离子电流变化情况可以推断过孔分子的物理尺寸和化学结构[30,31,32,33]。

本文研究了固态纳米孔单分子在限域空间内动态监测人体端粒序列DNA在金属离子诱导下形成G-四联体的方法，其原理如图1所示，通过对固态纳米孔共价修饰及离子电流信号检测分析，实现对G-四联体形成的监测。因分子间的G-四联体的不稳定性，在外电场力作用下结构容易解开，所以在孔内存在解开结构和形成结构的过程[34,35,36]，当没有离子支撑时，端粒序列不能形成G-四联体结构，DNA呈柔性，物理占位较小，而形成G-四联体后，其立体结构相较柔性DNA链会在孔内产生更大的物理占位，施加一定电压时，孔内离子电流下降，从而产生特征离子电流波动信号。

图1端粒序列DNA化学修饰在固态纳米孔内对G-四联体形成监测示意图

2、实验

2.1实验材料与仪器

本实验使用的氮化硅薄膜芯片购自Norcada，氮化硅薄膜厚度为20nm、基底厚度为200μm、窗口的大小为10μm×10μm。氯化钾（KCl）、氯化钠（NaCl）、氯化锂（LiCl）、三-（羟甲基）-氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）及修饰过程中用到的3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷（GOPS）试剂均从上海Aldrich订购。高效液相色谱法（HPLC）纯化的端粒序列DNA购自上海生工生物有限公司。所用的4种离子电导液的成分分别为1mol/LKCl、10mmol/LTris和1mmol/LEDTA(pH=8);5mol/LLiCl、20mmol/LKCl、10mmol/LTris和1mmol/LEDTA(pH=7.9);1mol/LNaCl、10mmol/LTris和1mmol/LEDTA(pH=7.9),950mmol/LLiCl、50mmol/LKCl、10mmol/LTris和1mmol/LEDTA(pH=7.9），分别标记为电导液1～4。上述溶液均使用自来水净化系统（Molecular1850D）的HPLC级水制备。实验中氮化硅薄膜芯片的修饰过程需要采用“食人鱼”溶液（浓硫酸与体积分数30%的过氧化氢的体积比为3∶1）进行浸泡处理，修饰过程中用到的甲苯、丙酮和乙醇购自川东化工。实验中所用到的端粒序列DNA为5′NH2-C12-(AGGGTT)2-3′。

计算机程序LabVIEW控制Keithley2450电脉冲输出仪作为打孔装置输出电脉冲，使用Axopatch200B膜片钳放大器（Axopatch200Bamplifier）测试纳米孔的精确I-V曲线和电流变化的数据。膜片钳技术是一种通过记录离子通道中离子电流的变化来观测细胞膜或者单个离子通道活动的技术，也可用于任何形式的离子通道的监测。

2.2纳米孔的制备

使用电击穿法制备纳米孔，将氮化硅片用水和乙醇清洗数遍，装入定制的聚四氟乙烯样品池装置中，如图2所示，分别加入1mol/LKCl、10mmol/LTris和1mmol/LEDTA(pH=8），用银/氯化银（Ag/AgCl）电极将样品池装置与用电脑控制的Keithley2450电脉冲输出仪连接，电流脉冲施加在样品池装置的一端。当电场达到临界值时，氮化硅薄膜就会发生击穿，从而在氮化硅薄膜上形成纳米尺寸的孔洞。本文所使用的氮化硅薄膜会在电脉冲达到18V左右时被击穿形成纳米孔洞，在相对较低的电压下对其进行扩大，从而达到目标孔径。孔径的大小可以用电流-电压（I-V）关系曲线计算，并且进行实时观测。

图2电介质击穿设备制备纳米孔示意图

2.3对纳米孔进行端粒序列DNA修饰

对纳米孔进行端粒序列DNA修饰的步骤分为3步。(1)活化纳米孔。将负载有纳米孔的氮化硅基片用有机溶剂及水清洗后烘干，然后采用赛奥特等离子清洗机在功率20～30W下进行氧等离子体清洗氮化硅薄膜，再在“食人鱼”溶液中室温浸泡30min，水洗去除酸液后，将纳米孔基片在100℃下烘干，使氮化硅表面具有丰富的羟基官能团以进行下一步反应。(2)修饰纳米孔上GOPS。将上述活化的纳米孔基片在手套箱内无水环境中浸入浓度为45μmol/L、已经过干燥的甲苯（用氢化钙回流24h，再蒸馏提取）作为溶剂的GOPS的溶液中室温反应30min，反应后将基片用经过干燥的甲苯溶剂加热清洗，再用丙酮加热清洗后烘干备用。(3)固定纳米孔内端粒序列DNA。将上述表面带有GOPS的纳米孔基片浸在含有0.1μmol/L的端粒序列DNA的缓冲液（成分为10mmol/LTris和1mmol/LEDTA(pH=7.5））中室温反应1～2h。反应后将基片取出用该反应缓冲液清洗。

2.4实验数据的采集与处理

将固定端粒序列DNA后的纳米孔基片装入样品池装置中，并分别在装置的两端先后加入电导液2,3和4[37]，并用Ag/AgCl电极将样品池装置与膜片钳相连，在一端施加电压，如图3所示，记录电流变化的数据。

图3膜片钳系统记录电流信号工作示意图

3、结果与讨论

3.1纳米孔修饰前后直径及亲水性的表征

在电导液中氮化硅薄膜表面带负电。如果施加特定电场，基于电介质击穿模型，可以根据通道电导的数值间接推算出击穿后所形成的纳米孔直径大小[38]，计算公式为

式中：d为纳米孔直径；l为通道长度即薄膜厚度；σ为溶液电导率；Gpore为孔电导。

图4为纳米孔修饰前后的示意图和I-V曲线图。图4(a）和（b）分别为修饰前后的纳米孔装置示意图。如图4(c）和（d）所示，裸氮化硅纳米孔和DNA修饰纳米孔在电导液1中测试的I-V曲线斜率明显不同，根据式（1）可得膜厚l=20nm，电导液电导率为10.49S/m，由I-V曲线斜率可分别推算出裸氮化硅纳米孔直径约为14.5nm，而修饰端粒序列DNA后纳米孔的直径约为1.5nm。

图4纳米孔修饰前后的示意图和I-V曲线图

图5为氮化硅薄膜表面修饰过程中的接触角表征结果。由图5可以看到，未作处理的氮化硅表面（图5(a））是疏水的，在浸泡“食人鱼”溶液后（图5(b））水与氮化硅表面的接触角（θ）明显变小，亲水性提高。修饰GOPS分子后（图5(c））的氮化硅表面与水的接触角增大，亲水性下降，这表明GOPS分子已经修饰到氮化硅表面，其末端的环氧基是疏水的，导致接触角变大。最后在氮化硅表面固定DNA后（图5(d）），其亲水性改善，接触角变小，说明端粒序列DNA修饰到了氮化硅片上，与前面修饰孔的I-V曲线测试结果吻合。纳米孔直径以及氮化硅表面与水的接触角的测试数据都证明了端粒序列DNA确实固定到了氮化硅的表面和孔内。

图5氮化硅薄膜表面修饰过程中的接触角表征

3.2纳米孔内固定端粒序列DNA后监测G-四联体的形成过程

为了检测端粒序列DNA在不同离子环境中的结构性质，将电导液2,3和4依次注入到纳米孔装置两端的腔室里。在两端施加相同的电压，捕获到了端粒序列DNA在纳米孔中因为结构的变化而产生的电流信号，将探测得到的电流信号进行统计并分析，图6～8为纳米孔装置在一端施加200mV电压，不同离子电导液中所得到的信号，图6～8中的图（a）是电信号的散点图，代表着孔内端粒序列DNA在金属离子诱导下形成立体结构产生的电流堵塞幅值和持续时间分布关系。而图6～8中的直方图则分别代表G-四联体结构形成后在孔内堵塞事件的信号幅值（图6(b）、7(b）和8(b））和持续时间（图6(c）、7(c）和8(c））的统计结果。可以看到在不同离子的电导液中，其产生的信号的幅值和持续时间都有很大不同。图中数据统计分析显示，在电导液3中信号的电流堵塞幅值分布最集中，在电导液2中次之，在电导液4中最分散。这说明相比于其他两种电导液体系，端粒序列DNA在电导液3中的构象转变没有另外两种电导液中的构象多样。在电导液2和电导液4中产生的信号分布范围比在电导液3中产生的信号分布范围更大，说明端粒序列DNA在电导液2和4中有更自由的结构变换，因此造成电信号的分布更加广泛。在200mV的电压下，在3种电导液中产生信号的幅值高斯拟合值和信号持续时间指数衰减拟合值如表1所示，可以看出在电导液3中信号的持续时间最长，这也说明了在电导液3中端粒序列DNA折叠成的G-四联体结构更加稳定，而在另外两种离子电导液中，信号的持续时间明显小。综合这两个方面来说，不管在信号幅值的分布上，还是在信号持续的时间上，都可以说明在电导液3中由端粒序列DNA折叠产生的G-四联体结构的稳定性最好。

图6200mV电压下在电导液4中产生信号的统计结果

图7200mV电压下在电导液2中产生信号的统计结果

图8200mV电压下在电导液3中产生信号的统计结果

表1在200mV的电压下、在不同离子电导液中产生信号的幅值高斯拟合值和信号持续时间指数衰减拟合值

实验探究了G-四联体在相同电压下不同离子电导液中的结构性质，在实验过程中发现G-四联体结构的性质和施加的电压也是相关的，所以进一步在电导液2中通过施加不同的电压，探索端粒序列DNA在纳米孔中因为结构的变化而产生的电流信号。实验分别在纳米孔装置的一端施加100mV、150mV和200mV的电压。在使用与上述相同方法对信号进行分析后，得到图7、9、10和表2数据，可以看到在相同离子电导液中，不同电压对端粒序列DNA产生G-四联体结构具有很大的影响，由散点图（图7(a）、9(a）和10(a））可见随着电压的增加，事件数明显增多，表明孔内G-四联体结构在外电场力作用下折叠与解折叠更频繁；事件的电流堵塞信号幅值（图7(b）、9(b）和10(b））随电压增大而增大，符合高电压下产生大的离子电流的趋势；而信号的持续时间分布直方图（图7(c）、9(c）和10(c））表明信号的持续时间明显减小，说明随着电压的升高G-四联体结构的稳定性逐渐降低。

图9在电导液2中100mV电压下产生信号的统计结果

图10在电导液2中150mV电压下产生信号的统计结果

表2在电导液2中不同电压下产生信号的幅值高斯拟合值、持续时间指数衰减拟合值

综上所述，实验中所用到的纳米孔装置可以检测不同电导液中端粒序列DNA折叠情况，而在相同的电导液中，电压的不同也会对端粒序列DNA折叠成的G-四联体结构稳定性有着很大的影响。

4、结论

本文提出了一种利用固态纳米孔单分子技术鉴别在不同金属离子媒介中端粒序列DNA形成不同G-四联体构象的方法。首先通过共价修饰技术成功将端粒序列DNA固定在氮化硅纳米孔内，并用接触角测试数据以及纳米孔修饰前后的I-V曲线特征表征了端粒序列DNA修饰的氮化硅纳米孔；在含有不同金属离子的电导液中实现了对G-四联体形成的检测。实验发现固定在氮化硅孔内的端粒序列DNA所形成的分子间G-四联体在电压的作用下并不稳定，其构象在折叠和解折叠之间变化，且在不同的金属离子环境中形成的不同尺寸的G-四联体构象在纳米孔中引起的电流堵塞也有明显差异；而在相同的金属离子环境下，施加电压的大小也会改变G-四联体的稳定性，随着电压的增加G-四联体结构的持续时间下降。实验结果为基于纳米孔单分子检测平台的G-四联体复杂构象的解析提供了新的方法，为利用纳米孔分析G-四联体等生物大分子复杂结构提供实验参考。

参考文献:

[9]应乐倩,余晖,王雨婷,等.端粒DNA损伤与细胞衰老的研究进展[J].中国细胞生物学学报,2018,40(3):109-117.

王森,梁丽媛,唐婧,蔡瑶,翁婷,尹雅洁,王亮,王德强.固态纳米孔上端粒序列的共价修饰与G-四联体折叠监测[J].微纳电子技术,2020,57(06):483-491.

基金:中国科学院青年创新促进会项目(2017392);重庆市基础科学与前沿技术研究重点项目(cstc2017jcyjB0105).