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关于SARS-CoV-2的基因组变异与分子诊断的研究进展

2020-07-07 700 上传者：管理员

摘要：快速准确的分子诊断是控制传染病和疫情暴发的关键工具。随着新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染导致的肺炎患者数量迅速增加和疫情蔓延,已有SARS-CoV-2基因组序列、核酸检测的诊断试剂和方法相继报道,高深度全基因组测序和RT-PCR是目前检测SARS-CoV-2的重要方法。但是,核酸检测阴性而影像学诊断阳性的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)案例逐步增加,因此,提高核酸分子诊断的效能和灵敏度是亟待解决的问题。目前,SARS-CoV-2的起源、动物和人的传播途径、分子诊断及临床治疗、疫情暴发科学预警等已经成为研究热点。本文从遗传学、基因组学、病毒学和进化生物学的角度,对SARS-CoV-2基因组变异与分子诊断的近期研究进展进行分析。通过比较SARS-CoV-2与SARS-CoV(SARS冠状病毒)基因组以及感染患者基因组变异,以期为精准快速的分子诊断、抗病毒药物的靶点筛选提供依据,同时为SARS-CoV-2追踪溯源、精准快速核酸分子诊断方案设计、临床防治提供新思路。

关键词：
SARS-CoV-2
分子分型
分子生物学
序列变异
新型冠状病毒
毒株
比较基因组
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2019年12月由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染的新型冠状病毒肺炎(COVID-19),对全球公共卫生造成了巨大的威胁[1,2]。COVID-19已纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病,按照甲类传染病管理。传染源主要来源于SARS-CoV-2感染者,无症状携带者也是传染源。临床数据表明,SARS-CoV-2感染的危重患者多见于老年人、糖尿病、高血压等有基础疾病的人群,但也表现出家庭聚集性的密切接触者感染[3]。COVID-19流行病学特点表现为人群的普遍易感性,潜伏期1～14d,大多为3～7d。临床主要症状为发热、乏力和干咳,危重症患者与SARS感染相似,出现急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克和DIC等,预后较差[3,4]。COVID-19已引起全球高度关注,很多国家已采取积极的措施,避免疫情进一步蔓延[5,6]。从分子水平对传染病进行快速而准确的诊断,了解病原体的致病机制,是控制疫情暴发的关键工具[7]。目前,SARS-CoV-2基因组序列已经绘制完成(NCBIBioProject:PRJNA485481)。结合流行病学史、临床表现、胸部CT和核酸检测可确诊COVID-19,但其精准快速的诊断方法仍需要优化,亟需开发抗SARS-CoV-2药物和疫苗[8]。本文从遗传学、基因组学、病毒学和演化生物学的角度,对SARS-CoV-2基因组变异与分子诊断的近期研究进展进行分析,通过比较SARS-CoV-2与SARS基因组以及感染患者基因组变异,以期为精准快速分子诊断、抗病毒药物靶点筛选提供依据,同时为SARS-CoV-2追踪溯源、精准快速的核酸分子诊断方案设计、临床防治提供新思路。

1、SARS-CoV-2溯源、变异与进化基础

LLOYD等[9]研究结果表明,携带未知病毒的蝙蝠、灵长类动物以及其他哺乳动物与人类频繁接触的地区,可能是新型传染病源高发的地区,如巴西的寨卡病毒和西非的埃博拉病毒疫情[10]。人类将不同的野生动物聚集在非自然环境中,其携带的病毒等微生物可能产生致病的基因变异,通过排泄物、分泌物等方式传递给人类,从而致病。

冠状病毒最先是1937年从鸡体内分离出来,病毒颗粒的直径为60～200nm,平均直径为100nm,呈球形或椭圆形,具有多形性。病毒有包膜,包膜上存在棘突,整个病毒像日冕,不同的冠状病毒的棘突有明显的差异。人类冠状病毒感染引起的临床症状轻微,致病性弱。前期已发现6种(HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV)可以感染人的冠状病毒,SARS-CoV-2是最新发现的第7种冠状病毒[11]。

SARS-CoV-2在系统分类上属冠状病毒科冠状病毒β属。本文收集的SARS-CoV-2全基因组数据来源于NCBI和新型冠状病毒信息库,相关项目编号为PRJCA002165[5,11]。

通过上述基因组数据,本研究组采用最大似然法构建进化树。结果显示,SARS-CoV-2与SARS和蝙蝠冠状病毒亲缘关系最为接近(图1)[12]。SARS-CoV-2与蝙蝠冠状病毒、SARS拥有共同的祖先序列,在全基因组序列上有重要的相似性。SARS-CoV-2基因组全序列与蝙蝠冠状病毒基因组全序列同源性达87.99%,SARS-CoV-2基因组全序列与SARS基因组全序列同源性为79.5%[13]。

图1SARS-CoV-2与其他病毒的进化树(最大似然法)

2、SARS-CoV-2的基因组结构、功能与致病亚型

NCBI发布了SARS-CoV-2全基因组序列信息,长度为29.9kb。本研究组根据上述结果和GUAN等[14]发布的SARS基因组数据绘制了环形图(图2),基因组结构和注释显示,SARS-CoV-2有11个功能基因(表1),其中3个同源于SARS,7个同源于蝙蝠冠状病毒,1个功能未知。在基因组中找到单核苷酸多态性(SNP)位点22个。

SARS-CoV-2基因组发现的22个SNP位点中,17个SNP位点分布在编码区,5个SNP位点分布在非编码区。图3显示了这些多态性SNP位点的基因组坐标和在碱基变化,图4显示了SARS-CoV-2ORF3a和ORF8基因的蛋白序列变异;全基因组未能找到STR遗传变异序列。

表1SARS-CoV-2蛋白编码基因注释信息

依据SARS-CoV-2现有的标准参考序列,通过全基因组序列比对,发现其中有2个毒株的序列有缺失。第一处位于序列起始端,存在15个碱基缺失序列,第二处在序列末端,存在11个碱基缺失序列(图5)。

图2SARS-CoV-2全基因组结构图、SNP位点、蛋白编码基因在基因组分布

本研究组利用国家生物信息中心(CNCB)/国家基因组科学数据中心(NGDC)发布的SARS-CoV-2数据进一步分析了其基因组变异和临床表型有关个体致病亚型,发现SARS-CoV-2基因组存在毒株差异,表现为编码区域致病基因17个单碱基突变位点,可能引起致病基因变异。

病毒的遗传变异,是两个不同的病毒株通过抗原转移或者基因重排,形成新的病毒株,病毒RNA的SNP无论是在病毒自身序列还是在其靶序列都可能存在。研究不同病毒RNA和靶序列的多态性,可以更好地达到干扰或过表达病毒RNA的效果,同时还可以有助于了解疾病的发生机制。基于发表的临床基因组数据[2,3],研究SARS-CoV-2的SNP的差异显示可能形成了新的毒株(图3)。因此,基于不同的临床表型,通过高通量快速准确的数字PCR技术和全基因组分型技术,得到更多的毒株亚型的序列多态性数据,建立与疾病亚型对应的毒株亚型,这对于指导临床治疗具有重要意义。

图3SARS-CoV-2的SNP在不同菌株的分布

3、SARS-CoV-2核酸分子诊断进展

目前临床上出现了一些胸部CT检测阳性,而SARS-CoV-2核酸检测的病例情况。按照国家卫生健康委员会《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)》要求,定义相关病例如下。①疑似病例:有/无流行病学史,且同时符合临床表现中2条;②临床诊断病例:疑似病例具有肺炎影像学特征者;③确诊病例:临床诊断病例或疑似病例,具备以下病原学证据之一者。一是呼吸道标本或血液标本RT-PCR检测SARS-CoV-2核酸阳性,二是呼吸道标本或血液标本病毒测序,与已知的SARS-CoV-2高度同源,有/无流行病学史,临床症状,影像学表现符合肺炎特征,SARS-CoV-2核酸检测阳性。

图4SARS-CoV-2的ORF3a和ORF8基因的蛋白序列变异

图5SARS-CoV-2不同菌株序列变化

从临床表现看,SARS-CoV-2核酸检测必须结合临床、影像学、流行病学资料进行综合分析,才能确诊COVID-19和感染者;同时需要开发更灵敏和更特异的检测技术和靶向治疗方法,以满足临床的防控需求。

依据SARS-CoV-2复制的过程,目前可检测病毒的技术或者方法有定量PCR、多重PCR、反转录等,主要针对病毒正链单股RNA、抗体等[15,16]。许多实验室和公司都是依据上述原理开发SARS-CoV-2的诊断试剂。但目前对不同公司试剂盒的性能尚无第三方评价数据。随着检测结果的假阴性报道[17],评估试剂盒的灵敏度、特异度以及准确性已迫在眉睫。

病毒RNA序列的多态性研究,旨在全基因组序列中设计引物对,包含RNA基因组序列变异特征,识别包括SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV等,不局限于检测SARS-CoV-2两个特有基因(orf1ab和N基因)。第三代Nanopore纳米孔测序技术可以直接捕获RNA,揭示SARS-CoV-2基因组的变异,不需要RNA的逆转录和扩增,可以直接检测病毒RNA中的SNP位点。因此,通过增加COVID-19患者样品中RNA亚型诊断的可行性,可以为基于亚型的病毒确认和毒株变异分析提供可能。

此外,微流控数字PCR将微升级别的PCR反应体系分割成数万至数十万个纳升级甚至是皮升级别的微小反应单元,每个反应单元中不含靶标DNA或者含有1个至多个靶标DNA,对各独立反应单元进行PCR扩增,检测最终各反应单元内是否有目标扩增产物,进而通过泊松分布即可计算出初始样本中靶标DNA的绝对拷贝数量,整个过程耗时一般为45～90min。理论上数字PCR可检测到单分子级别的靶标DNA,是目前所有核酸检测手段中灵敏度最高的技术手段之一,因此,数字PCR可快速检出痕量病毒,有效筛选病毒携带者。数字PCR可检测出0.01%的突变率,甚至可以检出0.001%以下的突变率。相比而言,实时荧光定量PCR或者被称作定量PCR(qPCR)反应的检测极限在101个靶标数量级上,无法检测单分子靶标。当待测靶标丰度很低(0.1%～1%)时,qPCR同样难以从复杂背景信号的前提下分辨出目标信息。通常新一代测序可检测1%～5%的低丰度突变,更低的突变丰度则需要依赖数字PCR。

4、小结

目前,已有大量的基于全基因组测序和临床防治的SARS-CoV-2研究[2,11,13],但仍缺乏精准而又快速的检测技术和针对SARS-CoV-2的靶向抗病毒药物和预防疫苗。随着环境的变化,越来越多的动物携带的病原体库出现在人类居住地,2011-2018年,世界卫生组织追踪了172个国家的1483起传染病疫情,仍有不可预测的新型疾病出现的可能性。因此,从遗传学、基因组学、病毒学和进化生物学的角度认识SARS-CoV-2,对病毒传染源进行追踪溯源,基于病毒基因组变异信息了解新型冠状病毒在动物、人类和环境中传播过程,将会为控制传染源和疫情预警提供最有力证据。结合病毒进化机制、致病基因变异、临床表型、医学影像、分子病理学,将实验室检测的基因型和COVID-19患者临床表型统一,建立SARS-CoV-2基于临床表型的毒株亚型和诊断标准,对于指导临床有效防治感染性疾病具有非常重要的价值。

参考文献：

[17]莫茜,秦炜,傅启华,等.正确认识新型冠状病毒核酸检测的影响因素[J].中华检验医学杂志,2020,43(3):213-216.

熊子军,张喆,王雅琦,朱德芹,郭佑民.新型冠状病毒的基因组变异与分子诊断[J].西安交通大学学报(医学版),2020,41(04):473-478.