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DNA条形码技术基础上舟山海域石莼附生动物的分子生物学鉴定

2020-11-16 148 上传者：管理员

摘要：我国绿潮暴发已持续10余年，对生态环境、旅游业等造成了严重影响。本文于2018年10月在舟山市枸杞岛附近海域采集石莼附生动物，并使用DNA条形码技术对其开展物种鉴定，旨在给绿潮暴发的生态防治提供数据参考。鉴定结果显示：附生动物主要分为麦秆虫亚目以及钩虾亚目，部分样品无法鉴定出具体种类，存在出现新种的可能性。优势种包括Caprellascauroides和Ampithoelacertosa等，其中Ampithoelacertosa在中国近海为首次记录。在上述基础之上，我们进一步探讨了各季节钩虾亚目不同物种对于藻类的取食偏好性，阐明了端足类生物在维持生态系统稳定性中发挥的重要作用，为防控绿潮暴发提供了新的思路。

关键词：
Cox1
DNA条形码
石莼
绿潮
附生动物
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绿潮（greentides）是一种在世界各国沿岸普遍易发的有害藻华[1]，是由海水富营养化造成石莼属Ulva等藻类大量增殖引起的生态现象[2,3,4]，通常发生在河口、海湾和城市海岸等富营养化程度较高的水域[5]。绿潮暴发给生态环境造成巨大破坏，给旅游观光业带来重大经济损失，同时也对核电站的安全造成潜在威胁，影响极其严重[6]。例如在加拿大的佩恩湾、美国的纳拉甘西特湾以及中国的厦门集美海域等处暴发的规模性绿潮[7,8,9]，其主要优势绿潮物种均为石莼。另外，在全球气候持续变暖的情况下，富营养化及水温升高驱动的绿潮暴发频率会增加[10,11]。通过增加生态系统中消费者数量的方式以减少藻类的生物量，可有效控制藻华的暴发规模[12]，因此研究石莼的附生动物有重要生态学意义。当前国内外主要针对绿潮优势种浒苔Ulvaprolifera开展生理生态、分子机制和防控等研究[13]，关于绿潮构成物种石莼虽有所研究[14]，但关注度欠佳。

我国海藻资源丰富，广布于南麂列岛、枸杞岛和荣成海藻场等，已有研究表明枸杞岛海藻场存在大量石莼生物资源[15]。大规模的贻贝养殖等造成枸杞岛海域营养盐含量较高[16]，这也为大型海藻的生长提供了充足的养分，岛屿潮间带和贻贝养殖区中的泡沫浮球等也为石莼生长提供了固着空间，而大型海藻又是众多小型无脊椎动物和鱼类良好的索饵场、栖息地和庇护所[17,18]，生态地位极其重要。

DNA条形码是一种有足够变异且易于扩增的相对较短的标准DNA片段。由于线粒体基因组具备结构简单、母系遗传且进化速率快等特征，目前已成为研究近缘种物种进化关系等的有效工具[19]。Cox1、Cox2和Cox3基因较为保守，是研究物种分子水平的系统进化以及分类关系的有效基因之一[20]，当前相关研究主要采用Cox1基因片段作为DNA条形码鉴定节肢动物等[21]。研究通过使用形态学和基于Cox1基因条形码技术对石莼附生动物进行物种鉴定、邻接法（neighbor-joining,NJ）系统发育树聚类分析以及ABGD(automaticbarcodegapdiscovery）遗传学分类验证，探讨石莼的附生动物对渔业资源保护及防控大型藻类暴发的相关启示。

1、材料与方法

1.1 实验材料

2018年10月，于浙江省舟山市枸杞岛贻贝养殖区附近海域（30.74°N,122.83°E）采集样品。选取6处不同位置的石莼，将摘取的海藻放入0.15mm孔径的筛绢网中，使用经过抽滤后灭菌的海水将石莼表面的附生动物冲洗至网内，对于附着较为紧密的生物则小心剥离取样。收集附生动物并将其置入离心管内，用75%酒精溶液固定，将石莼样品一并带回实验室。

经形态学鉴定，确认本实验采集的海藻团均为石莼（图1）。依照形态学相似度对附生动物进行初始分类，之后对样品编号并进行形态学摄影记录（图2），使用无水乙醇保存动物样品，便于后续开展DNA提取。

图1石莼形态学图片

1.2 线粒体DNA提取

使用购自上海生工生物技术有限公司的Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒提取DNA（操作详见试剂盒说明书），将DNA保存至-80℃冰箱备用。

1.3 PCR扩增及测序

使用一对通用引物开展相应PCR扩增：Cox1-F(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′）及Cox1-R(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′）[22]。40μL的PCR反应体系包含：0.1μL的DNA,20μL的PCR-mix，上下游引物各1μL以及17.9μL的dd-H2O。PCR扩增程序为：94℃预变性4min;94℃变性30s、45℃复性30s及72℃延伸30s共计30次循环；最终在72℃下延长5min并以4℃低温保存[23]。使用琼脂糖凝胶电泳染色检验PCR产物质量，将电泳条带清晰且无杂带的PCR产物送至上海生工生物技术有限公司开展Sanger一代测序。

图2附生动物形态图（同一比例尺）

1.4 分析方法及数据处理

使用BioEdit等软件检查序列是否准确，对不合格的碱基进行人工校对。在NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation）数据库中进行比对得到各序列对应的物种信息；运用Mega7.0软件[24]并采用邻接法，使用适用于开展节肢动物进化关系分析的Kimura双参数模型（Kimura-2-parameter,K2P）重复1000次Bootstrap构建发育树[25]，选取与研究对象亲缘关系较近的端足类物种Amphipodavoucher的同源序列（MH826052）作为外群。

采用基于遗传距离的ABGD分析方法对样本分类进行检验[26]。将序列上传到ABGD数据库（https://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/abgd/）。数据库中具体的参数设置如下：Pmin=0.001,Pmax=0.1,Steps=25,X(relativegapwidth)=1,Nbbins(fordistancedistribution)=25。

2、结果与讨论

2.1 附生动物的物种组成

本研究共获得36条长度为649bp的条形码序列。石莼附生动物由端足目2个亚目的物种组成：麦秆虫亚目Caprellidea及钩虾亚目Gammaridea，这与刘书荣等在枸杞岛海域开展的大型海藻附生动物基础调查研究结果相一致[27]。另外，2019年秋季石莼附生动物的优势物种包括：麦秆虫科Caprellidae的Caprellascauroides和藻钩虾科Ampithoidae的Ampithoelacertosa等（表1）。

表1样品的NDA条形码鉴定结果

其中，Ampithoelacertosa在中国近海为首次记录。截至目前，全球共发现藻钩虾属Ampithoe物种近90个[28]，而在中国海域内仅记录到4种[29]，该4种藻钩虾属物种主要发现于南海海域，本研究在东海枸杞岛海域发现了第5种藻钩虾属生物Ampithoelacertosa，这进一步表明，中国海域内的藻钩虾属物种多样性研究依旧存在较大空间。

另外，有16个样品无法在NCBI数据库中比对到种名。以中国已发现的近400种钩虾亚目物种为例[29]，其中多数物种属于中国特有种且未能建立起条形码信息，这也进一步导致该16个样品无法通过NCBI等数据库确定物种名称。当然，样品中也存在出现新种的可能性[30]，这有待进一步开展深入的研究。

2.2 附生动物分子分类结果及其生态学意义

Cox1基因是线粒体基因组中编码细胞色素C氧化酶的重要基因之一，其保守程度适用于种间及种以上阶元的分类分析与研究。Kimura双参数模型构建的附生动物的分子系统树显示（图3），本研究涉及的36个样品可分为4种，均属于端足目生物。ABGD分类方式中的递归划分及初始划分值最终也支持将36个样品分为4个物种（图4）。其中，两种可确定到物种名称（Caprellascauroides;Ampithoelacertosa），另两种虽无法确定种名，但种间区分明显（Group1;Group2）。

端足目生物生长周期短，繁殖速度快，在近海生态系统食物网中属于非常重要的营养级，也是优质的海洋动物饵料，例如，花鲈（Lateolabraxmaculatus）、褐菖鲉（Sebastiscusmarmoratus）、小黄鱼（Larimichthyspolyactis）等重要经济鱼类的生存都极其依赖端足目生物[31]。自2011年始，枸杞岛附近海域已多次暴发小规模绿潮，以2012年5月为例，枸杞岛附近海域暴发的绿潮对当地生态环境造成了严重影响[32]，同时也影响到旅游业的发展。若未来枸杞岛等海域再次暴发由外来或本地物种引发的规模性绿潮，依靠常规的绿潮藻清理方式只会影响小型无脊椎动物和鱼类的栖息地、食物来源及饵料，且会对当地渔业资源的可持续发展造成重大影响。

图3基于Kimura双参数法构建的石莼附生动物Cox1基因片段的NJ系统发育树

钩虾亚目种类与麦秆虫亚目种类对大型藻类的利用方式不同[33]，导致两者的种间竞争强度较弱，其中钩虾亚目种类主要以大型海藻（如石莼）作为栖息地和营养来源，而麦秆虫亚目种类主要以大型海藻为栖息地[27]。这进一步说明，钩虾亚目种类在控制绿藻生物量及保持区域内生态系统稳定的过程中能够发挥重要作用，例如藻钩虾科物种等[34]；另外，该科物种在食物源选择上也有所区分，虽然其大多以石莼属藻类等为食，但对于藻类物种的选择具备一定的取食偏好性[35]。我们认为，未来研究钩虾亚目种类在各季节对于不同藻类的取食偏好性具有重要的应用价值，在当前全球气候变暖及富营养化加剧的情况下，如果枸杞岛等海域再次暴发绿潮，在暴发初期进行适量打捞，与此同时，引入与之相关的消费者可起到生态防控作用。上述举措将会更好地保持当地生态系统的多样性与稳定性，具有明显的生态学意义。

图4以0.001～0.1为先验值区间对36个样本进行ABGD划分

3、结论

(1）根据2018年10月对枸杞岛海域6处不同位置的石莼附生动物开展的调查，结合相关历史资料，认为其附生动物由端足目两个亚目的物种组成：麦秆虫亚目以及钩虾亚目。秋季附生石莼的优势物种包括：麦秆虫科的Caprellascauroides和藻钩虾科的Ampithoelacertosa等。其中Ampithoelacertosa为首次在中国近海被记录。

(2）本研究涉及的两个物种未确定物种名，可能为新种或未能建立起与之相应的条形码数据库信息，中国海域内的端足目物种多样性研究依旧存在较大空间，可开展系统、完善的季节性采样调查。

(3）端足目生物在维持生态系统稳定性中发挥重要作用。此外，藻钩虾科物种对于石莼属生物具备一定取食偏好性，研究钩虾亚目不同物种在各季节对于不同藻类的取食偏好性等具备潜在的应用价值，这为防控绿潮暴发提供了新的思路及解决方法，也能更好地保持当地海域的生态稳定性，缩短生态自我修复所需的时间。

参考文献：

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