促性腺激素释放激素是一种神经肽类激素,是性激素合成与性腺发育的关键内分泌调控因子[1]。在鱼类和其它脊椎动物中,GnRH通过刺激垂体促性腺激素的产生从而调节性腺类固醇激素的合成与释放,促进性腺发育成熟[2],然而目前对贝类GnRH的调控机制了解甚少。近年来,在几种贝类体内均发现了GnRH多肽的存在,GnRH基因在虾夷扇贝和长牡蛎的神经组织中高度表达,且与脊椎动物GnRH基因相比具有较高的同源性和结构相似性[3,4,5]。此外,Rodet等在长牡蛎体内克隆到了GnRH受体基因,并发现该基因主要在雌雄性腺中表达[6]。Treen等研究发现GnRH多肽可刺激体外培养的虾夷扇贝精原细胞分裂[7]。目前在软体动物中尚未发现GtH同源基因的存在,Kah等[8]推测GnRH的作用方式可能随动物神经系统的进化而演变,在神经系统较为简单的无脊椎动物中,GnRH可能通过直接作用于性腺发挥其生殖调控作用,目前这一观点仍有待于进一步证实。

脊椎动物通过“GnRH-GTHs-性激素合成通路”调控性腺发育,性激素由孕烯醇酮通过Δ4和Δ5两种主要途径合成,这两条途径都涉及细胞色素P450c17(CYP17)以及3β-羟类固醇脱氢酶和17β-羟基类固醇脱氢酶[9]。在双壳动物体内,性激素(雌二醇、睾酮和孕酮等)已经被广泛的鉴定和量化,许多研究通过对双壳贝类性腺组织中类固醇激素代谢、生化变化的研究,提出双壳贝类体内性激素的主要合成途径与脊椎动物类似,且类固醇合成酶对性激素的生物合成至关重要,其中,CYP17、3β-HSD和17β-HSD是关键的性激素合成酶[10,11,12,13]。脊椎动物中CYP17、3β-HSD和17β-HSD在转录水平由GnRH、GtH通过其受体激活。然而在软体动物中这3种酶基因表达调控的相关研究尚未见报道。本文在前期克隆了菲律宾蛤仔rp-GnRH全长cDNA序列的基础上,设计并筛选了特异性干扰GnRHmRNA表达的dsRNA,旨在通过RNAi技术,研究菲律宾蛤仔rp-GnRH基因沉默对性腺中性激素合成相关基因表达的影响,进而探讨GnRH在菲律宾蛤仔生殖内分泌调控中的作用。

1、材料与方法

1.1dsRNA制备

采用体外合成法制备GnRH及绿色荧光蛋白的dsRNA用于干扰实验。根据菲律宾蛤仔GnRH基因序列信息(GenBankKF891317)和RNAi引物设计原则设计了两组不同的引物,并分别在每组引物的正义链和反义链的5’末端添加T7序列(见表1),以蛤仔脏神经节cDNA为模板,PCR扩增特异序列。根据绿色荧光蛋白(EGFP-C1,Clontech)序列信息设计RNAi引物,用以从EGFP-C1中扩增特异序列。

用TIANGEN纯化PCR产物,按照T7RiboMAXTMExpressRNAiSystem(Promega)试剂盒说明书的方法,体外合成用于干扰GnRH表达的dsRNA及EGFP-dsRNA(阴性对照),并用不含RNase的DNaseⅠ(Takara)消化模板DNA。将获得的dsRNA以1%琼脂糖凝胶电泳分析其大小和纯度,用核酸蛋白仪(Ultrospec2100)测定合成的dsRNA浓度和OD值,OD260/OD280为1.84～2.16。

表1RNAidsRNA合成引物导出到EXCEL

1.2GnRH-dsRNA筛选及不同时间作用下的干扰效率

菲律宾蛤仔于2017年11月采自青岛市红岛养殖场,壳长(3.4±0.3)cm,性腺发育处于休止期。实验前于实验室暂养一周,定期换水和投喂螺旋藻粉。将菲律宾蛤仔随机分为4组:空白对照组(PBS组)、阴性对照组(EGFP-dsRNA组)和2个GnRH干扰组(GnRH-ds1组、GnRH-ds2组),每组3个平行,每个平行注射3个个体。将体外转录合成的dsRNA溶解于灭菌的PBS缓冲液中,用注射器从菲律宾蛤仔双壳铰合部注入血腔中,其中空白对照组每个个体注射50μL灭菌的PBS,阴性对照组和2个GnRH干扰组每个个体分别注射50μL(10μg/50μL)的EGFP-dsRNA、GnRH-ds1和GnRH-ds2。参考王晓安等[14],菲律宾蛤仔脏神经节位于后闭壳肌膜上,在注射后的0、24、48和72h用镊子取脏神经节提取总RNA,用RT-qPCR法测定GnRH的表达水平,计算干扰率。

1.3不同浓度GnRH-dsRNA的干扰率

挑选36只健康的蛤仔,随机分为4组,根据GnRH基因干扰链筛选结果,参考合浦珠母贝(Pinctadafucata)[15]目的基因dsRNA的浓度设定,设定空白对照组(注射50μL灭菌的PBS)、阴性对照组(注射50μL20μg/50μLEGFP-dsRNA)、GnRH-ds1低浓度组(注射50μL20μg/50μLGnRH-ds1)和GnRH-ds1高浓度组(注射50μL30μg/50μLGnRH-ds1),于48h后用镊子取脏神经节提取总RNA,用RT-qPCR法测定GnRH的表达水平,计算干扰率。

1.4GnRH干扰对性腺发育相关基因的表达研究

将菲律宾蛤仔随机分为3组,包括空白对照组(PBS)、阴性对照组(EGFP-dsRNA)和GnRH-ds1组。空白对照组每个个体注射50μL灭菌的PBS缓冲液,阴性对照组每个个体注射50μLEGFP-dsRNA,RNAi组每个个体分别注射50μL筛选出的30μg/50μLGnRH-ds1。于48h后取性腺组织提取总RNA,用RT-qPCR法测定性激素合成相关基因的表达。

1.5基因表达的RT-qPCR分析

根据RNAisoPlus(TaKaRa,大连)说明书分别提取脏神经节、性腺总RNA。每一样品取1μg总RNA,按照TaKaRa,大连试剂盒说明书反转录合成cDNA,以cDNA为模版,进行实时荧光定量PCR反应用于检测rp-GnRH及性激素合成相关基因表达量,所用引物见表2。以18srRNA为内参基因,荧光定量数据分析采用2-ΔΔCt法。用SPSS22.0软件进行单因素方差分析(One-WayANOVA),采用Tukey’s多重比较检验差异显著性,以p<0.05作为差异显著标准。

表2荧光定量引物导出到EXCEL

2、实验结果

2.1两种GnRH-dsRNA干扰的效果检测

注射后的0、24、48和72h,提取脏神经节检测GnRH的相对表达量。结果表明,PBS组与阴性对照组(EGFP-dsRNA)相比,GnRH的表达量无显著性差异(p>0.05)。在注射后48h,两个干扰组GnRH的表达量出现显著下降(p<0.05),其中GnRH-ds1注射组GnRH表达量干扰率为63.3%,GnRH-ds2注射组干扰效率为38.9%(见图1)。

图1dsRNA注射对菲律宾蛤仔脏神经节GnRH基因表达的影响

2.2不同浓度GnRH-ds1的RNAi效果

根据2.1中GnRH的干扰效果,选择GnRH-ds1进行注射,设置浓度梯度为20μg/50μL和30μg/50μL,于48h取样检测抑制效果。结果表明,注射后48h,PBS组与阴性对照组相比,GnRH基因表达量无显著性差异(p>0.05)。高浓度(30μg/50μL)GnRH-ds1注射组的干扰率为73.3%,低浓度(20μg/50μL)注射组的干扰率为54.3%(见图2)。

图2不同浓度dsRNA注射对菲律宾蛤仔脏神经节GnRH基因表达的影响

2.3GnRH基因干扰后性激素合成基因表达量的变化

如图3所示,注射dsRNA48h后,GnRH干扰组的菲律宾蛤仔性腺中17β-HSD和CYP17的基因表达较空白对照组、阴性对照组显著性下降(p<0.05),而3β-HSD基因表达量没有出现显著变化(p>0.05)。与PBS对照组相比,GnRH干扰组中17β-HSD及CYP17基因的表达量分别下降了86.3%、84.9%;与阴性对照组相比,17β-HSD及CYP17基因表达量分别下降了78.6%、81.3%。

图3不同处理组3β-HSD、17β-HSD和CYP17基因的相对表达量

3、讨论

目前,RNAi作为一种简单、高效、特异性沉默同源目标基因的敲减工具,为动物基因功能的研究提供了新的思路和方法。Fabioux等体外合成了牡蛎性腺基因Oyvlg的RNA干扰链(Oyvlg-dsRNA),将其注射到牡蛎性腺中成功引起不育现象,首次证明双壳贝类体内注射dsRNA的有效性[16]。这项技术在日本合浦珠母贝、三角帆蚌、栉孔扇贝等双壳贝类中也均有应用报道[15,17,18]。RNAi在生物体内具有一定的时效性,多数研究表明RNAi持续的时间为2～4d。对甲壳动物的研究发现在南美白对虾和克氏原螯虾中,注射目的基因dsRNA干扰链后48h即可达到有效干扰效果[19,20]。Feng等探究栉孔扇贝Cf-dmrt-likemRNA基因功能时dsRNA注射后72hCf-dmrt-like表达量显著性降低[18]。本研究结果显示,GnRH-ds1干扰链注射后48h显著下降,在注射后72h,GnRH基因的表达量开始回升(见图1)。在RNAi实验中,dsRNA处理后目的基因mRNA表达水平下降70%被认为干扰有效[21]。已有研究表明在RNAi实验中dsRNA的有效注射浓度有所区别:如李颖翔等设计的长牡蛎Toll样受体(Toll-likereceptor)的dsRNA的有效注射浓度为100μg/100μL[22]。Fang等以合浦珠母贝为研究对象,设计了3种不同浓度的dsRNA用以抑制5个与贝壳矿化有关的基因的表达,结果显示高浓度组(160μg/100μLdsRNA)对目的基因的抑制率显著高于低浓度组(40μg/100μL或80μg/100μL)[15]。本研究结果显示向菲律宾蛤仔血腔中注射10μg/50μLGnRH-ds1和ds2即可抑制GnRH的表达(抑制率分别为63.3%和38.9%),但尚未达到有效抑制率,而注射30μg/50μLGnRH-ds148h后GnRH的抑制率达73.31%,说明脏神经节中GnRH的mRNA表达被有效抑制。由此可见,本实验中对GnRH基因的干扰效果也主要受到dsRNA注射浓度的影响有关,30μg/50μL为GnRH-ds1注射48h的有效浓度。

脊椎动物中促性腺激素释放激素(GnRH)是性激素合成与性腺发育的关键神经内分泌调控因子。对硬骨鱼类的研究发现,体内注射GnRH短期内可诱导垂体GTHs合成,同时注射GnRH和多巴胺拮抗剂可促进多数种类的性腺发育成熟[23,24]。目前关于软体动物GnRH功能的研究较少:Lisa等研究发现人工合成的真蛸(Octopusvulgaris)GnRH多肽可促进离体培养的真蛸卵巢和精巢组织中孕酮、睾酮和雌二醇含量显著升高[25,26];Nakamura等采用人工合成的GnRH离体孵育虾夷扇贝(P.yessoensis)的精巢,发现可促进精原细胞分裂[27];Song等发现菲律宾蛤仔脏神经节rpGnRH基因表达在性腺发育过程中具有明显的变化规律,其相对表达量与血液中孕酮、睾酮的含量具有显著正相关性[5]。这些研究结果均体现了GnRH在软体动物的性腺发育与性激素合成中可能具有重要作用。脊椎动物中性激素合成关键酶CYP17、3β-HSD及17β-HSD等基因在转录水平受到GnRH和GtHs的调控[10],但是贝类中GnRH对性激素合成酶基因表达的影响尚未见报道。在本实验中,处于性腺发育休止期的菲律宾蛤仔的GnRH表达被抑制时,两种关键的性激素合成酶CYP17与17β-HSD的基因表达均显著下调,间接证实了双壳贝类中GnRH对其性激素合成的调控作用。另一方面,有研究表明,菲律宾蛤仔在性腺发育时期血淋巴中性激素水平(孕酮、睾酮和雌二醇)的含量及变化均存在雌雄差异[5],但是GnRH功能在软体动物中的性别差异研究尚未见报道。本实验中的受试菲律宾蛤仔处于性腺发育休止期,因此在本研究中未区分GnRH表达抑制对不同性别菲律宾蛤仔的影响,在今后的实验中将测试GnRH表达抑制对不同发育阶段、不同性别的菲律宾蛤仔性激素合成、主要性激素含量的影响,为查明GnRH在不同发育阶段和不同性别菲律宾蛤仔中的功能提供依据。

目前研究发现贝类体内的性激素合成途径与脊椎动物类似,主要由CYP17、3β和17β-HSDs等性激素合成关键酶介导完成[11,12,13]。Thitiphuree等研究表明CYP17、3β-HSD和17β-HSD在虾夷扇贝的外周和性腺组织中普遍表达,并且3β-HSD和17β-HSD基因的mRNA表达与性腺成熟度有关[28]。CYP17同时具有17α-羟化酶和17,20-裂解酶的两种活性,参与脊椎动物中孕烯醇酮和孕酮的17-羟化、催化17-羟孕酮转化为雄烯二酮和17-羟孕烯醇酮转化为去氢表雄酮(DHEA)。Mu等研究许氏平鲉发现,性腺中CYP17a1的表达与血清中睾酮浓度密切相关[29]。研究表明在斑点叉尾鮰和日本鳗鲡卵泡发育过程中,CYP17的含量变化极为显著[30,31]。早在1973年,De等利用使用氚和氧化标记的前体,在紫贻贝中发现了CYP17酶活性,随后Carreau等利用同样的方法在乌贼(SepiaofficinalisL.)性腺中也发现CYP17酶活性[32]。Thitiphuree等在虾夷扇贝性腺中克隆到了一种CYP17的cDNA全长,与脊椎动物氨基酸序列相比具有较高的保守性,并且虾夷扇贝CYP17mRNA的表达水平在配子早期分化阶段较高,在性腺成熟中期、后期受到抑制,说明CYP17在贝类的性腺发育过程中具有重要的作用[28]。在脊椎动物中,17β-HSD主要功能是参与性激素的代谢,通过调节细胞内甾体类激素水平从而在生殖系统中发挥重要作用。它可以将脱氢表雄酮转化为雄烯二酮,并能将雌酮转化为雌二醇。对贝类的研究表明,长牡蛎和虾夷扇贝的雌性性腺中均可检测到雌二醇和17β-HSD酶活性,且雌二醇的含量随性腺成熟升高,而排卵后17β-HSD的酶活性与早期性腺分化阶段相比明显降低[33]。Liu等通过实验证明栉孔扇贝中的17β-HSD能有效地将17β-雌二醇转化为雌酮,并可催化睾酮向雄烯二酮的转化。此外,栉孔扇贝雌雄性腺17β-HSD的表达量随配子发育而增加,在生长期和成熟期雄性性腺17β-HSD的表达量显著高于雌性性腺[34]。Zhou等研究证实九孔鲍(Haliotisdiversicolorsupertexta)中17β-HSD可以催化雌酮转化为雌二醇,并且在成熟期性腺内17β-HSDmRNA表达量显著升高,在产卵后显著性下降[35]。这些研究表明17β-HSD在贝类性类固醇激素的合成中发挥重要作用,进而调节贝类性腺发育。本研究结果显示,当GnRH表达被抑制时,CYP17、17β-HSDmRNA的表达均显著下降,由此我们推测在性腺发育处于休止期的菲律宾蛤仔中,CYP17、17β-HSD基因表达可能在转录水平受到GnRH的调控。

3β-HSD作为动物体内大多数性激素生物合成的关键酶,在睾酮生物合成中起限速酶的作用。Thitiphuree等通过RACE技术获得了虾夷扇贝性腺组织3β-HSD的cDNA全长,研究发现当扇贝性成熟出现大量生殖细胞时,3β-HSD的表达量最高[28],说明3β-HSD在贝类性腺发育中也可能具有重要作用。Lin等通过GnRH体外培养大鼠睾丸间质细胞发现,GnRH可促进细胞中3β-HSD的表达进而促进睾酮的分泌[36]。Chianese等研究发现蛙体内内源性大麻素通过与大麻素受体(Cannabinoidreceptor,CB1)结合抑制下丘脑GnRH分泌及GtH的释放从而降低了蛙睾丸中3β-HSD的表达进而影响睾酮的生成[37]。

本研究结果显示当GnRH被干扰时,菲律宾蛤仔性腺内3β-HSD的表达并没有发生显著变化。在脊椎动物中,3β-HSD可能受多种其他因素调节,如卵巢内ghrelin的表达参与抑制3β-HSD活性,降低性激素生成[38]。此外,3β-HSD主要表达于精巢间质细胞、精原细胞、颗粒细胞以及精子中参与睾酮的合成,其中精巢间质细胞是雄激素合成的主要场所,且仅在减数分裂时期发挥上述功能[39]。由此,我们推测菲律宾蛤仔雌雄性腺内3β-HSD的表达调控可能与其所处的性腺发育时期有关。

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基金:山东省自然科学基金面上项目(ZR2016CM31)资助.