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红景天苷通过下调HMGB1、自噬抑制肝癌细胞增殖和侵袭

2025-03-28 101 上传者：管理员

摘要：【目的】观察红景天苷抗肝癌机制。【方法】将H22肝癌细胞分为对照组（仅更换新鲜培养液）及红景天苷低、中、高剂量组，相应干预48 h。细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测细胞增殖活性，Transwell实验检测侵袭细胞数，单丹磺酰尸胺（MDC）染色法观察细胞自噬小体数量，实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）法和蛋白免疫印迹（Western Blot）法相应检测细胞高迁移率族蛋白1(HMGB1)，自噬相关基因酵母Atg6同系物（Beclin1）、微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3Ⅱ/Ⅰ)、选择性自噬接头蛋白62(p62)mRNA、蛋白表达量。【结果】与对照组比较，红景天苷低、中、高剂量组细胞增殖活性降低，侵袭细胞数和自噬小体数减少，p62 mRNA和蛋白表达水平升高，HMGB1、LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin1 mRNA和蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义（P <0.05），且呈剂量依赖性。【结论】红景天苷可能通过下调HMGB1表达及自噬水平抑制肝癌细胞增殖和侵袭。

关键词：
HMGB1
侵袭
增殖
红景天苷
肝癌
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肝癌具有隐匿性､转移早､进展快以及侵袭性强等发病特点,发病率呈逐年上升趋势,目前,手术切除､肝移植和化疗是临床治疗肝癌的主要手段,但是,仍存在耐药性､预后不良以及5年生存率低等情况,因此,寻求新的有效治疗肝癌的方法具有重要意义[1]｡肝癌归属于中医学“积聚”“癥瘕”“黄疸”“臌胀”等范畴,主要病机特点为“瘀､毒､虚”[2-3]｡红景天为景天科植物大花红景天Rhodiolacrenulata(Hook.f.etThoms.)H.Ohba的干燥根和根茎,味甘､苦,性平,归肺经和心经,具有益气活血､通脉平喘之功效｡现代研究[4-5]表明,红景天在治疗肝癌､保护肝脏方面具有一定的疗效｡红景天苷为红景天的有效活性成分,多项研究表明,红景天苷在体内､体外均具有明显的抗肝癌作用[6-10]｡但其具体机制尚不完全明确｡自噬相关基因酵母Atg6同系物(Beclin1)､微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3Ⅱ/Ⅰ)､选择性自噬接头蛋白62(p62)已成为潜在的预测肝癌患者预后的标志物[11]｡高迁移率族蛋白1(HMGB1)是存在于细胞核中的DNA合成蛋白,能够在细胞损伤或活化后从细胞核内转移到细胞质中,参与调控细胞自噬[12]｡因此,本研究通过观察红景天苷对肝癌细胞HMGB1､自噬的影响,探讨其抗肝癌的作用机制,以期为肝癌的临床治疗提供新的靶点和策略｡现将研究结果报道如下｡

1、材料与方法

1.1细胞系

小鼠H22肝癌细胞系,购自中国科学院上海细胞库｡

1.2药物､试剂和仪器

红景天苷(分子式:C14H20O7;分子量:300.3044)(苏州麦轮生物科技有限公司,批号:10338-51-9,纯度≥98%);RPMI1640完全培养基(美国Gibco公司);细胞计数试剂盒8(CCK-8)试剂盒(新疆宝信源柏生物技术有限公司);流式细胞术试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司);Transwell小室(美国Corning公司);RNA提取试剂盒以及逆转录试剂盒(美国Invitrogen公司);引物序列由广州锐博生物科技有限公司合成;HMGB1､Beclin1､LC3Ⅱ/Ⅰ､p62等抗体(美国Abcam公司)｡MultiskanFC酶标仪(美国赛默飞世尔科技公司);145-5050型PowerPac200电泳仪(美国Bio-Rad公司);TU-1800型紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);HT7800型荧光显微镜(日本日立Hitachi公司)｡

1.3细胞培养与分组干预

H22细胞于含10%FBS､1%青-链霉素的RPMI1640完全培养基中培养,置于37℃､5%CO2的恒温培养箱中,细胞密度达80%~90%时传代｡铺板时,96孔板接种密度为1×105个/mL,取200µL细胞悬液;6孔板接种密度为0.8×105个/mL,取2mL细胞悬液｡所有实验均使用状态良好的第3~5代细胞完成,3组重复｡当细胞生长至对数期时用于实验｡红景天苷用细胞培养基稀释并调节其终浓度为0.5､1.0､2.0mmol/L[13]｡将细胞随机分为对照组及红景天苷低､中､高剂量组｡各剂量组细胞分别采用0.5､1.0和2.0mmol/L红景天苷干预48h,对照组细胞仅更换新鲜培养基｡

1.4观察指标与检测方法

1.4.1CCK-8法检测细胞增殖活性

收集细胞悬液,接种于96孔板,按照“1.3”项中铺板､分组､干预方式,干预后将10µLCCK-8溶液加入各细胞孔,置于培养箱中继续培养2h｡酶标仪检测450nm波长处吸光度(OD)值｡细胞增殖活性(%)=实验孔OD值/对照孔OD值×100%｡

1.4.2AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率

收集细胞悬液,接种于6孔板,按照“1.3”项中铺板､分组､干预方式,干预后离心收集细胞悬液｡预冷PBS清洗3次,加入500µL的1×BindingBuffer重悬细胞｡再分别加入5µLPI和AnnexinV-FITC,避光孵育15min,上机检测｡

1.4.3Transwell实验测定细胞侵袭､迁移水平

细胞侵袭实验:将稀释后的基质胶加至Transwell的上室,置于37℃培养箱中培养30min,下室内加入600µL完全培养基｡消化6孔板中预先按照“1.3”项中方式干预后4组细胞,上室内加入5×105个细胞,培养箱内培养24h后,将上室未侵入的细胞用湿棉签轻轻拭去｡下室内的细胞用PBS冲洗后以4%甲醇固定,0.1%结晶紫染色,封片后显微镜下挑选5个视野进行细胞计数｡细胞迁移实验:迁移细胞数检测方法除不铺基质胶外,其余操作同上｡

1.4.4单丹磺酰尸胺(MDC)染色观察自噬小体

收集细胞悬液,接种于6孔板,按照“1.3”项中铺板､分组､干预方式,干预后加入0.05mmol/LMDC溶液37℃孵育15min｡PBS清洗3次,4%多聚甲醛溶液固定15min,荧光显微镜下观察｡

1.4.5qRT-PCR法检测HMGB1､Beclin1､LC3和p62mRNA水平

收集细胞悬液,接种于6孔板,按照“1.3”项中铺板､分组､干预方式,干预后离心收集各组细胞｡预冷PBS清洗2次,TRIzol试剂提取细胞中总RNA,紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度｡根据逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA,以cDNA为模板进行实时定量PCR扩增｡反应条件设置为:变性:95℃､30s,95℃､15s;退火:60℃､30s;延伸:72℃､15s｡进行40个循环｡采用2-△△CT法进行计算HMGB1､Beclin1､LC3和p62mRNA表达量｡引物序列见表1｡

表1引物序列

1.4.6蛋白免疫印迹(WesternBlot)法检测细胞HMGB1､Beclin1､LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62蛋白水平

收集细胞悬液,接种于6孔板,按照“1.3”项中铺板､分组､干预方式,干预后离心收集各组细胞｡预冷PBS清洗2次,放射免疫沉淀分析(RIPA)裂解液和蛋白酶抑制剂混合液裂解收取总蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度｡加入5×上样缓冲液,调整蛋白浓度,煮沸｡40µg蛋白样品用于电泳,120V电泳1.5h,0.3A恒流湿转2h,洗膜,室温封闭2h｡一抗(1∶1000)4℃孵育过夜,二抗(1∶5000)室温孵育3h,洗膜,滴加ECL发光液显色,曝光｡应用ImageJ分析条带灰度值,计算目的蛋白表达水平以目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值表示｡

1.5统计方法

采用SPSS21.0统计学软件进行数据分析,所有数据均符合正态分布,以均数±标准差(x±s)表示,多样本比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验｡以P<0.05为差异有统计学意义｡

2、结果

2.1各组细胞增殖活性比较

与对照组比较,红景天苷低､中､高剂量组细胞增殖活性降低(P<0.05),且呈剂量依赖性｡见表2｡

表2各组细胞增殖活性比较

2.2各组细胞凋亡率比较与对照组比较,红景天苷低､中､高剂量组细胞凋亡率升高(P<0.05),且呈剂量依赖性｡见表3､图1｡

表3各组细胞凋亡率比较

图1流式细胞术检测各组细胞凋亡结果

2.3各组细胞迁移､侵袭能力比较

与对照组比较,红景天苷低､中､高剂量组侵袭和迁移细胞数减少(P<0.05),且呈剂量依赖性｡见表4､图2｡

表4各组迁移､侵袭细胞数比较

图2Transwell法观察各组细胞迁移､侵袭结果(×40)

2.4各组细胞自噬小体数量比较

与对照组比较,红景天苷低､中､高剂量组自噬泡堆积减少,荧光强度减弱(P<0.05),且呈剂量依赖性｡见表5､图3｡

表5各组荧光强度比较

图3MCD染色观察各组H22细胞自噬的结果(×100)

2.5qRT-PCR法检测结果

与对照组比较,红景天苷低､中､高剂量组p62mRNA水平升高,HMGB1､LC3和Beclin1mRNA水平降低(P<0.05),且呈剂量依赖性｡见表6｡

表6各组细胞中HMGB1､LC3､Beclin1和p62mRNA表达水平比较

2.6蛋白印迹法检测结果

与对照组比较,红景天苷低､中､高剂量组p62蛋白表达水平升高,HMGB1､LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);与红景天苷低剂量组比较,红景天苷中､高剂量组p62蛋白表达水平升高,HMGB1､LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);与红景天苷中剂量组比较,红景天苷高剂量组p62蛋白表达水平升高,HMGB1､LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)｡见表7､图4｡

表7各组细胞中zGB1､LC3-Ⅱ/Ⅰ､Beclin1和p62蛋白表达水平比较

图4各组细胞中HMGB1､LC3-Ⅱ/Ⅰ､Beclin1和p62的WesternBlot条带

3、讨论

目前,研究[6-10]已表明,红景天苷可能通过提高机体免疫功能､抑制TopoⅡ的催化活性､激活凋亡的线粒体途径等在体内､体外均具有明显的抗肝癌作用｡本研究结果亦表明:红景天苷可抑制肝癌细胞的增殖活性,降低肝癌细胞的侵袭能力,具有抗肝癌作用｡研究[14]发现,细胞内主要通过蛋白酶泛素系统和自噬降解蛋白,其中,自噬是细胞内物质在溶酶体中被传递和降解的主要途径,通过对受损的细胞器和错误折叠蛋白进行靶向降解,从而为细胞更新和维持稳态提供新的能量｡自噬对肝癌的发生发展具有双重作用[15]:肝癌形成早期,通过自噬可维持内环境稳定,抑制肿瘤的发生发展;而当肝癌发展到一定阶段,肿瘤细胞可利用自噬适应各种不同的环境,如缺氧或营养缺乏,从而对肝癌的进展发挥促进作用｡有研究[16]表明,红景天苷通过激活自噬促进肺癌A549细胞凋亡｡本研究结果显示:红景天苷干预后,H22细胞自噬泡数量减少,Beclin1mRNA和蛋白表达水平降低,p62mRNA和蛋白表达水平升高,LC3-Ⅱ/Ⅰ表达水平降低｡提示红景天苷可通过调节自噬相关基因表达抑制肝癌细胞的自噬水平｡

HMGB1是HMG的主要家族成员,是一种重要的促炎性细胞因子,其可通过介导炎症级联反应导致组织损伤｡HMGB1被证明在肝癌患者癌组织中存在高表达,而且是肝癌患者术后发生急性肝衰竭的危险因素[17]｡细胞外HMGB1通过增加CD44表达促进肝癌细胞侵袭､球体形成和上皮间质转化[18]｡研究[19]发现,HMGB1通过诱导自噬,促进人肝癌细胞对阿霉素的耐药性｡本研究结果显示,红景天苷可抑制H22细胞HMGB1蛋白表达,提示红景天苷可能通过抑制HMGB1表达抑制肝癌细胞｡

综上所述,红景天苷可抑制肝癌细胞增殖和侵袭能力,其作用机制可能与抑制HMGB1表达及自噬水平有关｡但是本研究仍存在不足之处,仅仅停留在细胞水平,缺乏动物模型数据的支持,因此本研究需要进一步补充和完善｡

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基金资助:河南省高等学校重点科研项目(编号:23B320006);