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苦参碱对肝癌细胞HepG2生长凋亡的作用及机制

2020-09-29 258 上传者：管理员

摘要：目的探讨苦参碱(Matrine)在体外对HepG2细胞生长、凋亡的影响。方法使用不同浓度的苦参碱,作用于肝癌细胞HepG2后,倒置显微镜下观察癌细胞的凋亡现象,增强型细胞计数试剂盒(CKK)-8检测HepG2细胞毒性实验;流式细胞术行AnnexinV-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)双标记法检测苦参碱对体外培养的HepG2的凋亡作用。结果不同浓度的苦参碱在体外对HepG2细胞有明显抑制作用,细胞毒性随苦参碱浓度加大而增强。同时AnnexinV-FITC/PI双标记法检测苦参碱对HepG2细胞都有凋亡作用。结论苦参碱在体外对HepG2细胞生长有抑制作用,同时可诱导细胞凋亡。

关键词：
抗肿瘤作用
细胞凋亡
细胞生长
肝癌
肝癌HepG2
苦参碱
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肝癌是全球第六大常见癌症[1],近年来中老年肝癌发病率呈上升趋势,病情进展迅速,预后不良,对人类健康构成严重威胁[2]。中国肝癌死亡占世界的53%,主要影响到中老年人[3]。肝癌几乎总是由潜在的疾病引起,但这种疾病的来源在世界各地差别很大,包括乙型肝炎病毒(HBV)[4]、不良饮食和缺乏活动[5]及真菌毒素[6]。肝癌通常预后差,5年生存率估计低于9%[7]。

苦参碱(Matrine)是传统中药苦参[8]中的一种重要成分[9,10],它是一种喹啉类生物碱,其分子式为C15H24N2O,苦参碱已被验证具有广泛的药理作用[11,12],如抗乙肝病毒治疗慢性乙型肝炎等[13]。近年来,大量文献报道苦参碱具有良好的抗癌活性[14]。本文拟分析苦参碱对肝癌细胞HepG2生长、凋亡的作用及机制。

1、材料与方法

1.1试剂与药物

苦参碱(上海源叶生物科技有限公司)纯度≥98%,环磷酰胺为上海华联制药有限公司生产,RPMI1640培养基(Gibco公司生产),胎牛血清(FBS,Biologicalindustries);AnnexinV-异硫氰酸荧光素(FITC)细胞凋亡检测试剂盒和增强型细胞计数试剂盒(CCK)-8(碧云天)。

1.2细胞株

HepG2肝癌细胞由吉林大学基础医学院病原生物学系常规传代培养。

1.3主要仪器设备

基础电泳仪Bio-Rad,紫外透射仪:北京六一;凝胶成像分析系统:上海富山;聚合酶链反应仪(PCR),电热恒温培养箱:中仪国科(北京)科技有限公司;二氧化碳培养箱MCO-175,倒置荧光摄影分析显微镜LX71:奥林帕斯;BD公司流式细胞仪:ACCURIC6;全波长酶标仪:瑞士Tecan。

1.4肝癌细胞培养

用含10%FBS的DMEM培养基,37℃、5%CO2恒温恒湿培养。2～3d换液1次,细胞长至80%～90%时,用0.25%胰蛋白酶消化并按1∶2比例传代。冻存细胞时,将细胞悬浮于含90%FBS、10%二甲基亚砜(DMSO)的DMEM冻存液中。细胞培养传代数在30～40代之内,取对数生长期细胞用于实验。

1.5贴壁细胞

收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100μl,铺板使待测细胞浓度为5×104/孔,边缘孔用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)填充。5%CO2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物。5%CO2,37℃孵育16～48h,倒置显微镜下观察。每孔加入20μl噻唑蓝(MTT)溶液(5mg/ml),继续培养。终止培养,小心吸去孔内培养液。每孔加入150μlDMSO,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD450nm处测量各孔的吸光值。苦参碱配制为1g/L的无菌溶液备用。用完全培养基逐级稀释制成浓度依次为0.0625,0.1250,0.2500,0.5000,1.0000mg/ml的苦参碱工作溶液备用。

1.6体外抑制肝癌HepG2细胞实验

将HepG2细胞调整为5×104个/孔。接种96孔细胞培养板,每孔200μl,分别加入不同浓度苦参碱,每种浓度8个复孔,另设环磷酰胺对照,分别0.0625,0.1250,0.2500,0.5000,1.0000mg/ml5个浓度,8个复孔。另设调零孔。培养板于37℃,5%的CO2细胞培养箱中48h,加入20μl/孔增强型CCK-8溶液,其他以此类推。同时用加了相应量细胞培养液和增强型CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。在细胞培养箱里继续孵育0.5～4.0h,分别在450nm测定吸光度,分别取培养0.5h、1.0h、4.0h分别用酶标仪检测,测得OD值。实验数据会因检测的仪器有所不同。

1.7流式细胞术(FCM)检测肝癌细胞凋亡

(1)取6孔板以5×104个/ml的浓度接种细胞悬液,200μl/孔,设对照组(PBS组)和苦参碱组,细胞贴壁后按分组加入药物,置培养箱孵育24h后,胰酶消化成单细胞悬液,PBS洗涤2遍,1000r/min离心5min,弃上清,缓慢加入预冷的70%乙醇,4℃过夜。离心弃乙醇,PBS洗涤2遍,加入RNA酶,37℃水浴30min,加入碘化丙啶(PI)后4℃避光染色30min。FCM分析各组的DNA含量和细胞周期各时相的变化,实验重复3次。凋亡细胞为AnnexinV标记阳性,PI染色阴性。(2)调整待测肝癌HepG2细胞浓度为5×104个/ml。取1ml细胞,1000r/min、4℃离心10min,弃上清。加入1ml冷的PBS,轻轻震荡使细胞悬浮。1000r/min、4℃离心10min,弃上清。对于贴壁细胞,先用胰酶消化,再用PBS洗涤。将细胞重悬于200μl结合缓冲液。加入10μlAnnexinV-FITC,轻轻混匀,避光室温反应15min或4℃反应30min。加入300μl结合缓冲液,再加入5μlPI,即可上机检测。

1.8统计学方法

采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析。

2、结果

环磷酰胺0.1250、0.2500mg/ml时,苦参碱0.5000、0.2500mg/ml时,对肝癌HepG2细胞抑制显著(P<0.05),见表1。经过苦参碱处理后肝癌细胞凋亡明显增加,并且随着苦参碱浓度的增加细胞凋亡的比例也随之升高。见图1。

表1不同浓度环磷酰胺、苦参碱对肝癌HepG2细胞的抑制作用

图1流式细胞术检测肝癌细胞凋亡

3、讨论

苦参碱对几种肿瘤细胞类型[15],包括肝癌、胰腺癌、胃癌和乳腺癌有较为明显的抗肿瘤作用[16,17,18]。苦参碱通过抑制癌细胞增殖和诱导癌细胞凋亡而显示出抗肿瘤作用[19],同时有引发细胞凋亡蛋白酶依赖的独立程序细胞死亡的能力,显示出化疗的潜力。1995年苦参碱被中国食品药品监督管理局(CFDA)批准为非小细胞肺癌、肝癌的抗癌药物,并与其他抗癌药物配伍使用[20],苦参碱因此也被已用于治疗肝病和保护肝功能,尤其是作为肝癌治疗的辅助药物。体内和体外研究表明,苦参碱剂量依赖性降低了HepG2细胞的存活率,增加了凋亡率[21,22]。苦参碱在细胞周期的G0/G1阶段明显抑制HepG2细胞,提示细胞周期进展迟缓可能是苦参碱抗增殖作用的机制之一[23]。不同浓度的苦参碱体外作用肝癌HepG2细胞株有抑制作用,苦参碱通过抑制线粒体自噬和PINK1/Parkin通路的新机制促进肝癌HepG2细胞凋亡[24]。

李旭,陈岚,岳园,于军.苦参碱对肝癌细胞HepG2生长凋亡的作用及机制[J].中国老年学杂志,2020,40(18):3944-3947.

基金:吉林省科技发展计划项目(No.20180201049YY).