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新型肝癌组织的体外三维培养模型

2020-10-13 206 上传者：管理员

摘要：目的:利用肝癌组织进行体外的三维(three-dimension,3D)组织块培养,通过添加PD98059和霍乱毒素(choleratoxin,CT)优化培养条件,建立一种高活性的肝癌组织体外培养模型。方法:收集中山大学肿瘤防治中心肝胆科的肝癌组织标本,经清洗、冻存、复苏等处理后分为对照组、PD组、CT组、PD+CT组,同时进行体外的二维(two-dimension,2D)和三维培养。各组组织采用DNA断裂的原位末端标记法(TUNEL)检测组织细胞凋亡情况,qRT-PCR检测BCL-2、BID、Caspase3、CyclinD1、CDK2、ELK-1、C-FOS、C-MYC、C-JUN等相关基因的mRNA表达水平,免疫荧光染色检测BCL-2和cleavedcaspase-3蛋白表达情况,筛选并确定最优的体外培养方法。结果:3D培养组的组织细胞凋亡均少于2D培养组;PD98059通过上调BCL-2蛋白的表达,下调cleavedcaspase-3蛋白的表达,激活MEK/ERK下游基因,从而减少体外培养的组织细胞凋亡,增强其抗凋亡能力;霍乱毒素通过上调CyclinD1、CDK2的基因表达,促进其增殖。结论:我们开发了一种新型肝癌组织的体外三维培养模型,它可以作为进一步的药物试验和人源性异种移植(PDX)模型的工具。

关键词：
3D培养
mRNA表达水平
PD98059
原代组织
肝癌
肝细胞癌
霍乱毒素
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肿瘤基础研究需要合适的临床前模型,一直以来,以人源性肿瘤细胞系为主的二维(2D)体外培养模型是肿瘤研究的有力工具。2D培养的细胞系多为贴壁或悬浮生长,可无限增殖,连续传代,倍增时间短,这对于基础研究、药物研发、高通量筛选都十分有利。然而细胞系长期体外传代培养后,转录组、基因组、染色体数目等会发生改变[1,2];此外单层的细胞系适应了体外培养皿的环境,缺乏瘤内异质性和肿瘤微环境的作用,无法重现肿瘤的原始空间结构,难以客观真实地反应肿瘤的实际特性,这也许是导致体外药敏实验与临床药物试验结果出现差异的原因之一[3]。因此需要进一步地完善以模拟体内肿瘤的生长模式。

随着组织工程学的发展,三维(3D)培养模型应运而生[4]。它是指利用各种生物学材料作为支架,如基质胶、胶原、聚乳酸、聚乙醇酸等,一方面为细胞提供空间环境,使其能形成立体的分布,模拟肿瘤内环境;另一方面,基质胶、胶原等材料富含胶原、蛋白、酶以及各种生长因子,能提供良好的基质成分,为肿瘤细胞的生长提供有利的微环境,对内皮细胞的生长、肿瘤细胞的黏附、侵袭、血管生长都具有促进作用[5],在肿瘤生物学、干细胞研究、药物筛选等[6,7]方面具有极大的潜力。

原发性肝癌是最常见的高度恶性肿瘤之一,具有易多发、转移、复发等特点[8]。在我国每年新发病例占全球新发病例的半数以上,其中80%～85%的原发性肝癌病理类型为肝细胞癌[9]。郭亚焕等[10]发现,肝癌细胞株HepG2在二维和三维培养中,显示出不同的生物学特性。因此,本实验以人体手术的肝细胞癌组织块为研究对象,利用人工基质胶(Matrigel),进行体外的3D组织培养,并通过添加细胞外信号调节激酶抑制剂PD98059[11]和蛋白激酶A激动剂霍乱毒素(choleratoxin,CT)[12]优化培养条件,开发一种高活性的人原代肝癌组织体外培养模型,为进一步的药物试验和人源性异种移植(patient-derivedxenograft,PDX)模型提供新的工具。

1、材料与方法

1.1实验试剂

培养所用的RPMI1640培养基、双抗、谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸、牛血清白蛋白、胰岛素购自美国Invitrogen公司;表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购自美国PeproTech公司;PD98059、霍乱毒素、DMSO购自美国Sigma公司;胎牛血清(FBS)购自美国Invitrogen公司;Matrigel购自美国Corning公司;TUNEL检测试剂盒购自美国Roche公司;RNA逆转录试剂盒、TBGreenTMPremixExTaqTMII均购自中国Takara公司;BCL-2、cleavedcaspase-3一抗均购自美国CST公司;荧光标记的二抗、DAPI均购自美国的Invitrogen公司;其他常用化学试剂购自Sigma公司和上海生工公司。

1.2耗材与仪器

耗材:48孔的细胞培养板,OCT冷冻包埋剂,载玻片,盖玻片,暗盒,切片盒,冻存管,匀浆管,研磨珠,PCR管等;仪器:超净工作台(Thermo),二氧化碳恒温培养箱(Thermo),正置荧光显微镜(Leica,DM6B),全自动组织脱水机(珊顿),组织切片机(Leica),组织匀浆机Precellys24(Bertin),离心机(Eppendorf),PCR仪(Eppendorf),qRT-PCR仪(Bio-Rad)等。

1.3标本收集

新鲜肝癌组织取自2018年9月至2018年10月中山大学肿瘤防治中心肝胆外科,切取手术肿瘤标本中无明显坏死的任意区域,直径约2～3cm的组织,将其置于预冷的含双抗的RPMI1640培养基,冰上运回实验室。5例患者均知情同意,且术前均未行化疗或放疗,均无远处转移,均经病理科确诊为肝细胞癌。本研究经医院伦理委员会批准(批准号:YB2018-005)。

1.4肝癌组织冻存与复苏

冻存:超净工作台中,首先去除肿瘤组织中的坏死组织、脂肪组织和血凝块,之后将其剪切为2～3mm3大小的组织块,用含双抗的PBS洗涤3～4次,将5～7块组织放入含1mL冻存液(90%FBS+10%DMSO)的冻存管中。冻存管在4℃冰箱放置1h后,转移到-80℃冰箱过夜,之后将其储存至液氮中。复苏:将肿瘤组织从液氮中取出,37℃水浴锅融化,用含双抗的PBS洗涤2～3次。

1.5肝癌组织体外培养

超净工作台中,准备48孔的细胞培养板和复苏的组织。对于2D培养组,每孔放入2～3块组织块,添加400μL的培养基,具体分组及培养基成分见表1。对于3D培养组,每孔平铺60μL人工基质胶,将培养板放置于恒温培养箱15～20分钟,使基质胶凝固;随后在每孔中放入2～3块组织块,再添加120～160μL人工基质胶,使其覆盖组织块;最后添加400μL的培养基,具体分组及培养基成分同2D培养组。所有组织在恒温培养箱中培养60天,每3～4天更换一次培养基。

表1实验分组及培养基成分

1.6TUNEL免疫荧光染色检测组织凋亡

取培养后的组织,经4%多聚甲醛固定,常规梯度蔗糖脱水、OCT包埋,制备15μm冰冻切片。根据TUNEL检测试剂盒说明书,按步骤进行凋亡染色:PBS漂洗,在含0.1%TritonX-100的0.1%柠檬酸钠液中冰上孵育2～5min;滴加TUNEL反应液(现配现用),湿盒中避光,37℃恒温箱中孵育60min;PBS漂洗,DAPI溶液染核,常温中避光孵育10～15min;抗荧光淬灭液封片,4℃避光保存切片。荧光显微镜于200倍视野下拍照,每张玻片随机取3个视野。

1.7mRNA检测

取培养后的组织,组织匀浆机进行破碎匀浆,TRIzol法提取组织的总RNA;常规进行逆转录反应,获得cDNA;合成的cDNA用TBGreenTMPremixExTaqTMII进行qRT-PCR实验,检测BCL-2、BID、Caspase3、CyclinD1、CDK2、ELK-1、C-FOS、C-MYC、C-JUN等基因的mRNA表达。所有引物均由擎科生物公司合成,见表2。

表2qRT-PCR引物

1.8免疫荧光染色检测BCL-2和cleavedcaspase-3蛋白表达

取培养后的组织,经4%多聚甲醛固定,常规梯度蔗糖脱水、OCT包埋,制备15μm冰冻切片。PBS漂洗,5%BSA室温封闭60min;滴加BCL-2和cleavedcaspase-3一抗,4℃湿盒中过夜孵育;PBS漂洗,滴加相应种属的荧光标记的二抗,室温下湿盒中避光孵育1～2h;PBS漂洗,DAPI溶液染核,常温中避光孵育10～15min;抗荧光淬灭液封片,4℃避光保存切片。荧光显微镜于400倍视野下拍照,每张玻片随机取3个视野。

1.9统计学处理

所有免疫荧光染色实验均采用ImageJ1.48软件获得平均荧光强度的半定量数据。所有数据均以均数±标准差(x¯±s)表示。应用GraphPadPrism5.0软件进行非配对t检验的统计分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1PD98059可减少2D和3D培养中的TUNEL阳性细胞

为了评估和比较培养后肝癌组织的活性,我们进行了TUNEL免疫荧光染色,检测组织细胞凋亡情况。可以发现无论是2D培养(图1A)还是3D培养(图1B),PD组的阳性凋亡细胞均少于对照组,PD+CT组的阳性凋亡细胞少于CT组;另外,CT组的阳性凋亡细胞几乎与对照组相同。平均荧光强度的半定量数据分析证实了这一结果(图1C-D),并且,3D培养整体的组织凋亡均少于2、D培养(图1E)。

2.2mRNA表达变化

为了进一步验证培养后肝癌组织的变化,我们进行了qRT-PCR检测相关mRNA的表达情况,主要有抗凋亡基因BCL-2,促凋亡基因BID、Caspase3,增殖相关基因CyclinD1、CDK2,MEK/ERK下游基因ELK-1、C-FOS、C-MYC、C-JUN(图2)。可以发现:①PD组和CT组均上调BCL-2的表达,下调BID的表达;但同时PD组下调Caspase3的表达,而CT组上调Caspase3的表达;②PD组和CT组均上调CyclinD1、CDK2的表达;③PD组上调了ELK-1、C-FOS、C-MYC、C-JUN的表达。

2.3BCL-2和cleavedcaspase-3蛋白表达变化

qRT-PCR检测中观察到凋亡相关基因的瞬时变化,为了进一步验证其长期表达变化,我们检测了BCL-2和cleavedcaspase-3蛋白表达。可以发现在2D培养(图3A)和3D培养(图3B)中,PD组和CT组均上调BCL-2蛋白的表达,平均荧光强度的半定量数据分析证实了这一结果(图3C-D)。但同时,在2D培养(图4A)和3D培养(4B)中,PD组的cleavedcaspase-3蛋白少于对照组,PD+CT组的cleavedcaspase-3蛋白少于CT组;CT组的cleavedcaspase-3蛋白几乎与对照组相同,平均荧光强度的半定量数据分析证实了这一结果(图4C-D)。

3、讨论

在体外模型中,我们同时进行了肝癌组织的2D(无Matrigel)培养和3D(添加Matrigel)培养,并且评估了PD98059和霍乱毒素(CT)对组织细胞的凋亡、增殖的影响。

程序性细胞死亡是维持正常细胞内环境平衡、清除病理细胞的重要调控机制,其中凋亡是作用最广泛的一种形式。细胞接收激素、免疫因子等凋亡信号,胞核固缩,胞质破碎,裂解成凋亡小体,进而被溶酶体等吞噬消化。细胞凋亡有两种经典途径,首先是外源性途径,也被称为死亡受体途径,是由体外的促凋亡配体和细胞表面的死亡受体结合而激活,并与相关衔接蛋白组成死亡诱导信号复合体(thedeath-inducingsignalingcomplex,DISC),进而招募pro-caspase8和pro-caspase10。pro-caspase8、pro-caspase10在DISC中成熟为Caspase8、Caspase10,并将下游的Caspase3裂解为cleavedcaspase-3,启动凋亡程序[13]。第二是内源性途径,也被称为线粒体途径,其中BCL-2家族蛋白起着关键的调控作用。内源性凋亡信号激活BCL-2家族中促凋亡的成员,如BAX、BAK、BID、BIM,促进线粒体释放细胞色素C(cytochromeC)。细胞色素C与Apaf-1、pro-caspase9形成复合体,pro-caspase9在复合体中成熟为Caspase9,并裂解下游Caspase3,激活凋亡[14]。因此无论在外源性途径还是内源性途径,cleavedcaspase-3都是启动凋亡的最终执行者,此外,BCL-2家族的抗凋亡成员,包括BCL-2、BCL-X、MCL-1等,以负反馈的方式维持细胞凋亡的平衡[15]。

图1TUNEL免疫荧光染色检测组织凋亡(×200)

A:2D培养组;B:3D培养组;C-E:平均荧光强度半定量数据分析。

图2qRT-PCR检测组织相关基因mRNA表达情况

图3免疫荧光染色检测组织BCL-2蛋白表达(×400)

A:2D培养组;B:3D培养组;C-D:平均荧光强度半定量数据分析。n=5;红色:BCL-2蛋白;蓝色:DAPI;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图4免疫荧光染色检测组织cleavedcaspase-3蛋白表达(×400)

A:2D培养组;B:3D培养组;C-D:平均荧光强度半定量数据分析。n=5;红色:cleavedcaspase-3蛋白;蓝色:DAPI;*P<0.05。

有研究认为MEK抑制剂PD98059能通过抑制MEK/ERK信号通路,调节细胞周期蛋白依赖性激酶的表达,诱导G1期阻滞,诱导细胞凋亡,并与化疗药物产生协同作用[16];也有研究认为PD98059可以降低细胞活性氧自由基水平,减少ERK1/2的磷酸化,上调抗凋亡成分,下调促凋亡成分等方式减少凋亡,并且促进体外干细胞的生长[17,18]。我们的研究发现,当在体外培养中添加PD98059时,凋亡的细胞减少,其机制可能与抗凋亡蛋白BCL-2的上调,促凋亡蛋白cleavedcaspase-3、BID的下调,以及MEK/ERK下游基因的激活有关,另外PD98059能够上调了CyclinD1、CDK2的mRNA表达,因此PD98059在该体系中具有抗凋亡的作用,并且在一定程度上促进细胞增殖。

霍乱毒素(CT)作为蛋白激酶A的激动剂,是培养中常规的添加物,能显著促进上皮细胞和干细胞增殖[19],我们的结果也支持这一结论。CT能显著上调抗凋亡蛋白BCL-2的表达,但同时它也能显著上调促凋亡蛋白cleavedcaspase-3的表达,两者的效应相互抵消,所以CT组的凋亡几乎和对照组一样;另一方面CT显著上调了CyclinD1、CDK2的表达,因此CT在该体系中主要起到促增殖的作用。除此之外,3D培养组整体的组织细胞凋亡均少于2D培养组,证实了3D培养的效果优于2D培养。

根据上述的体外结果,我们筛选出最优的培养方案,即添加PD98059和霍乱毒素的3D培养。应用该新型模型,我们已经成功构建经体外培养的肝癌组织的PDX小鼠模型[20]。当然,本实验仍存在以下不足有待进一步探索和研究:首先体外3D培养模型中,没有比较培养后的组织和原始肿瘤组织在肿瘤细胞基因谱表达水平、肿瘤异质性、肿瘤微环境等方面的异同,后续实验可进一步验证;其次体外培养时间较长,后续将针对时间进行进一步优化,有望将该模型应用于药效评价及药物筛选中。

参考文献:

[10]郭亚焕,南克俊,崔洁,等.三维与二维培养肝癌HepG2细胞的药物敏感性及生物学特性比较[J].现代肿瘤医学,2010,18(09):1691-1694.

[20]尹萌,陈焕鹏,李永超,等.经体外培养的肝癌组织人源性异种移植小鼠模型的建立[J].热带医学杂志,2019,19(5):564-567.

尹萌,陈焕鹏,李永超,郭荣平,林小军,刘忠华,余波澜,黄朝峰,赵擎宇.新型肝癌组织的体外三维培养模型[J].现代肿瘤医学,2020,28(21):3673-3678.

基金:广东省省级科技计划项目(编号:2015A030302016).