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miR-182靶向NUMB调控结直肠癌细胞的影响及机制研究

2020-10-13 142 上传者：管理员

摘要：目的:研究miR-182对结直肠癌细胞HT-29增殖、迁移和侵袭的影响,并探讨其机制。方法:运用qRT-PCR检测人正常结肠上皮细胞HCoEpiC、结直肠癌细胞HT-29中miR-182、NUMB的表达;将anti-miR-con组(转染anti-miR-con)、anti-miR-182组(转染anti-miR-182)、pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA-NUMB组(转染pcDNA-NUMB)、anti-miR-182+si-con组(anti-miR-182和si-con共转染)、anti-miR-182+si-NUMB组(anti-miR-182和si-NUMB共转染)均用脂质体法转染HT-29细胞;Westernblot检测各组细胞中NUMB的蛋白表达;Transwell检测各组细胞的迁移和侵袭;MTT法检测各组细胞的增殖;双荧光素酶报告基因检测实验检测各组细胞的荧光素酶活性。结果:与人正常结肠上皮细胞HCoEpiC相比,结直肠癌细胞HT-29中miR-182表达显著升高,NUMB表达显著降低(P<0.05);抑制miR-182、过表达NUMB均可下调HT-29细胞的增殖、迁移、侵袭;NUMB是miR-182的靶标。敲减NUMB可逆转抑制miR-182对HT-29细胞增殖、迁移、侵袭的下调作用。结论:miR-182可促进结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭,其机制可能与靶向NUMB有关,将可为miR-182靶向治疗结直肠癌提供依据。

关键词：
miR-182
NUMB
侵袭
增殖
结直肠癌
迁移
靶向治疗
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miRNA为长度在19～25个核苷酸的高度保守的内源性短链非编码微小单链RAN分子[1]。它通过碱基互补配对方式与靶基因3'UTR部分或完全互补,在转录后水平调控靶基因的表达[2]。据报道,miR-182在多种癌症中均具有调控作用,其在结直肠癌中发挥促癌作用[3],但具体的作用机制尚未完全清楚。NUMB是细胞命运的关键决定因素,其最初是在果蝇中发现的一种进化上高度保守的蛋白质,具有高级结构复杂性和多种可变剪接形式[4]。它在多种生理、致病调节系统和肿瘤发生中起重要作用[5]。有证据表明,NUMB具有多种功能,并参与许多过程,包括控制干/祖细胞增殖和分化、细胞黏附、细胞迁移、内吞作用和癌症干细胞增殖[6,7,8,9]。NUMB在人类成人多种组织中及各种肿瘤组织中[10]均可表达。虽已有研究报道NUMB在结直肠癌中具有调节作用,但其在结直肠癌中的作用机制尚未完全清楚。本研究将以结直肠癌细胞HT-29为研究对象,检测miR-182、NUMB在其中的表达,观察抑制miR-182、过表达NUMB、敲减NUMB对HT-29细胞增殖、迁移和侵袭的影响,揭示其机制可能与miR-182靶向负调控NUMB有关,将为结直肠癌的预防和治疗提供新靶点。

1、材料与方法

1.1材料

人正常结肠上皮细胞HCoEpiC、结直肠癌细胞HT-29购自ATCC;DMEM培养基、胎牛血清、MTT试剂、胰蛋白酶均购自美国GIBCO公司;LipofectamineTM2000、BCA蛋白定量试剂盒、逆转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒购自大连Takara公司;Transwell小室、基质胶均购自美国Coming公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养

采用含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养人正常结肠上皮细胞HCoEpiC和结直肠癌细胞HT-29,置于37℃,5%CO2的培养箱中常规培养。

1.2.2细胞转染

将anti-miR-con、anti-miR-182、pcDNA、pcDNA-NUMB、anti-miR-182+si-con、anti-miR-182+si-NUMB均按照脂质体LipofectamineTM2000使用说明书要求转染至HT-29细胞,分别标记为anti-miR-con组、anti-miR-182组、pcDNA组、pcDNA-NUMB组、anti-miR-182+si-con组、anti-miR-182+si-NUMB组。转染成功后,用于后续试验。

1.2.3Westernblot实验

取适量对数生长期1.2.2各组细胞,RIPA裂解后用BCA进行定量,变性离心后取上清进行蛋白上样。按照Westernblot实验常规操作流程进行电泳-转膜-封闭-Ⅰ抗孵育-Ⅱ抗孵育-显影曝光。ImageJ分析目的条带的灰度值,以目的条带灰度值与β-actin灰度值的比值表示目的蛋白NUMB的表达。

1.2.4qRT-PCR实验

取适量对数生长期1.2.2各组细胞,遵照RNA抽提试剂盒说明书要求操作提取RNA,进行定量,然后按逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA。最后按qRT-PCR试剂盒说明书操作进行miR-182检测。用2-△△Ct计算miR-182、NUMB的表达。

1.2.5MTT实验

取适量1.2.2各组细胞,加入20μL5g/L的MTT溶液,培养3.5/4h,然后弃去上清,每孔加入150μLDMSO,震荡,使结晶溶解,在490nm波长下检测细胞光密度(OD)。细胞的增殖力与吸光值成正比。

1.2.6Transwell实验

将1.2.2各组细胞以106个/孔接种于细胞6孔板,培养至融合度80%时,更换无血清培养基培养过夜。调整细胞密度至105个/mL,取100μL加入上室内,600μL含血清的培养基加入下室,培养过夜。取出小室,用棉签擦去上室内的细胞,PBS洗涤,甲醇固定30min,0.1%结晶紫染色20min,PBS洗涤。显微镜下观察小室下表面附着的迁移细胞数,随机选5个视野计数,取平均值。

将Transwell小室上表面铺适量厚度的基质胶,然后按照上述操作方法操作。最后显微镜下观察小室下表面附着的侵袭细胞。

1.2.7双荧光素酶报告基因检测实验

取适量对数生长期1.2.2各组细胞,遵照双荧光素酶报告基因检测试剂盒技术手册要求操作。psiCHECK2载体以萤火虫荧光素酶活性为内参,psiCHECK2-NUMB3'UTR-WT和psiCHECK2-NUMB3'UTR-MUT的表达为对照,转染24h后,检测荧光强度。海参荧光素酶的发光强度与萤火虫荧光素酶发光强度的比值即反应miR-182与NUMB的结合力。

1.3统计学处理

实验中所有数据均采用SPSS21.0软件进行分析。计量资料用均数±标准差(x¯±s)表示,多组间数据比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1miR-182和NUMB在结直肠癌细胞和正常结肠上皮细胞中的表达

与HCoEpiC组相比,HT-29组细胞中miR-182表达显著升高,NUMBmRNA表达显著降低,NUMB蛋白表达显著降低(图1,表1),差异均具有统计学意义(P<0.05)。

图1结直肠癌细胞和正常结肠上皮细胞中NUMB的表达

表1结直肠癌细胞和正常结肠上皮细胞中miR-182和NUMB的表达x¯±s

2.2抑制miR-182对结直肠癌细胞增殖的影响

与anti-miR-con组相比,anti-miR-182组细胞中miR-182表达显著降低,在第48、72h时细胞增殖显著降低(表2),差异均具有统计学意义(P<0.05)。

表2抑制miR-182对结直肠癌细胞增殖的影响x¯±s

2.3抑制miR-182对结直肠癌细胞迁移和侵袭的影响

与anti-miR-con组相比,anti-miR-182组细胞的迁移量显著降低,细胞的侵袭量显著降低(图2,表3),差异均具有统计学意义(P<0.05)。

2.4过表达NUMB对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

与pcDNA组相比,pcDNA-NUMB组细胞中NUMB蛋白表达显著升高(图3),在第48、72h时细胞增殖显著降低,细胞迁移量显著降低,细胞侵袭量显著降低(表4),差异均具有统计学意义(P<0.05)。

图2Transwell实验检测抑制miR-182对结直肠癌细胞迁移和侵袭的影响(结晶紫染色×200)

表3抑制miR-182对结直肠癌细胞迁移和侵袭的影响x¯±s

2.5miR-182靶向NUMB

通过TargetScan对可能与miR-182结合的NUMB进行预测,发现miR-182靶向NUMB结合的可能性很高(图4A)。用双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞的荧光活性,与miR-con组相比,miR-182组野生型(WT)细胞的荧光活性显著降低,突变型(MUT)细胞的荧光活性不受影响(表5);与miR-con组相比,miR-182组细胞中NUMB蛋白表达显著降低,与anti-miR-con组相比,anti-miR-182组细胞中NUMB蛋白表达显著升高(图4B,表6),差异均具有统计学意义(P<0.05)。

图3结直肠癌细胞中NUMB蛋白表达

表4过表达NUMB对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响x¯±s

图4miR-182靶向NUMB3'UTR

A:miR-182与NUMB3'UTR具有结合位点;B:NUMB蛋白表达。

表5miR-182对结直肠癌细胞中双荧光素酶活性的影响x¯±s

2.6抑制miR-182和敲减NUMB对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

与anti-miR-con组相比,anti-miR-182组细胞在第48、72h时细胞增殖显著降低,细胞迁移数目显著降低,细胞侵袭数目显著降低;与anti-miR-182+si-con组相比,anti-miR-182+si-NUMB组细胞在第48、72h时细胞增殖显著升高,细胞迁移数目显著升高,细胞侵袭数目显著升高(表7),差异均具有统计学意义(P<0.05)。

表6结直肠癌细胞中NUMB蛋白表达

注:与miR-con组相比,*P<0.05;与anti-miR-con组相比,#P<0.05。

表7抑制miR-182和敲减NUMB对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响x¯±s

注:与anti-miR-con组相比,*P<0.05;与anti-miR-182+si-con组相比,#P<0.05。

3、讨论

miRNA在肿瘤中的调节作用已成为肿瘤研究的热点,其通过靶向调控mRNA的转录后表达,影响各种癌症的发生发展[11]。miR-182在肺癌、乳腺癌、膀胱癌等多种癌症中均异常表达,特别是结直肠癌[12,13,14]。马钦等[15]运用基因芯片杂交技术对结肠癌及癌旁正常组织中的miRNA进行分析并进一步用靶基因预测软件分析发现,有8个miRNA在结肠癌中表达显著上调,3个miRNA显著下调,其中miR-182为结肠癌中差异性最显著的上调miRNA。Cekaite等[16]研究发现,在结直肠癌中miR-9、miR-31和miR-182的失调表达可通过促进肿瘤细胞增殖和存活在结肠癌的发展中发挥重要作用。缪向来[17]在结肠癌的研究中发现,患者血清中miR-182表达显著升高,miR-195显著降低,且miR-182的靶基因IL-6在患者中表达上调,miR-195的靶基因p53在患者中表达下调。Liu等[18]研究阐明,miR-182在结直肠癌组织中表达上调,且与肿瘤大小、转移及存活率显著相关,提示miR-182在结直肠癌组织中表达上调并且与不良临床特征和预后不良相关。本研究运用qRT-PCR检测了结直肠癌细胞HT-29和正常结肠上皮细胞HCoEpiC中miR-182的表达发现,miR-182在HT-29细胞中高表达,这与前人的研究结果均相一致;进一步运用MTT、Transwell检测抑制miR-182的HT-29细胞的增殖、迁移和侵袭发现,抑制miR-182可抑制HT-29细胞的增殖、迁移和侵袭;深入研究运用双荧光素酶报告基因检测实验证实,miR-182靶向NUMB,且miR-182可负向调控NUMB的表达。

NUMB是细胞命运决定因素,其在有丝分裂中的不对称分配,通过拮抗NOTCH家族的质膜受体的活性来控制细胞命运选择[19]。国内外均有研究证实,NUMB参与多种癌症的发生发展[20,21,22],包括结直肠癌[23]。杨永涛等[24]研究报道,NUMB在结直肠癌组织中的表达明显降低,且与癌症的分期具有显著的相关性,提示NUMB在结肠癌中具有重要作用。Peng等[25]在结直肠癌的研究中阐明,miR-31-5p高表达,且靶向NUMB,敲低miR-31-5p、过表达NUMB均具有抑制结直肠癌细胞HT29增殖、迁移、侵袭的作用,且NUMB的表达量受miR-31-5p的负向调控,提示miR-31-5p通过靶向结直肠癌细胞中的NUMB促进癌细胞增殖、迁移和侵袭。本研究运用qRT-PCR、Westernblot检测了结直肠癌细胞HT29中NUMB的表达发现,NUMB低表达,且过表达NUMB可抑制HT29细胞增殖、迁移和侵袭,这均与Peng的研究结果相吻合。深入研究发现,敲减NUMB可逆转抑制miR-182对HT29细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。

综上所述,miR-182可促进结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭,其机制可能与靶向负调控NUMB有关,为结直肠癌的靶向治疗提供新靶点。

参考文献：

[3]刘广阔,侯志平,何培元,等.Hsa-miR-182-5p在结直肠癌组织中表达的临床意义及预后分析[J].世界最新医学信息文摘,2018,18(34):178-179.

[15]马钦,杨烈,王存,等.应用微阵列芯片分析结肠癌组织中miRNA差异性表达[J].四川大学学报(医学版),2011,42(03):344-348.

[17]缪向来.结肠癌患者血清miRNA特异性表达谱及其靶基因筛选鉴定研究[J].胃肠病学和肝病学杂志,2015,24(01):28-31.

[23]曾蕴林,邵喜明,李华顺.膜相关蛋白Numb在结肠癌中的表达和意义[J].四川大学学报(医学版),2012,43(01):6-8,14.

[24]杨永涛,刘艺,李连勇,等.Numb分子在结肠癌组织中的表达及其与临床分期的相关性[J].临床与病理杂志,2017,37(10):2057-2061.

罗俊波,郑瑞锋,王彦威,文海英,李璟.miR-182靶向NUMB调控结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究[J].现代肿瘤医学,2020,28(21):3679-3683.