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肝细胞癌患者外周血中Midkine、CTCs的表达水平及临床意义

2021-10-12 159 上传者：管理员

摘要：目的:探讨老年男性浸润性膀胱癌患者的诊治及预后因素。方法:回顾性分析2007年1月1日至2017年12月31日于我院收治男性浸润性膀胱癌患者中年龄≥70岁的尿路上皮癌患者115例。所有患者均行根治性膀胱全切术,依据预后结局将患者分为删失组及死亡组,比较两组基线资料、治疗方法及预后情况,采用log-rank检验进行单因素分析,Cox风险比例回归模型进行多因素分析,并绘制有意义变量的生存曲线。结果:在115例患者中,48例患者术后全因死亡,决定患者预后的独立危险因素是ASA分级(HR=2.645,P=0.001)和辅助化疗(HR=2.453,P=0.005),患者的1、3、5年总生存率分别为77.9%、65.4%、45.3%。结论:根治性膀胱全切术+盆腔淋巴结清扫术是治疗老年男性浸润性膀胱癌的主要方式,年龄并不是影响患者预后生存的独立危险因素,其生存期可能与ASA分级及术后辅助化疗有关。

关键词：
CTCs
Midkine
临床病理特征
肝癌
肝癌的诊治
肝细胞癌
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原发性肝癌是位居全球第五位的恶性肿瘤，具有发病率高、病情进展快、死亡率高等特点。我国肝炎患者的数量居世界首位，每年有大量的肝炎患者在肝硬化的基础上发展为肝癌，据统计，中国肝癌新发病例数占全球的50%以上。近年来，有学者认为循环肿瘤细胞(CTCs)是肿瘤复发及转移的重要因素，既往研究发现，CTCs在多种肿瘤的发生转移中发挥重要作用。许多研究发现，中期因子(Midkine)在多种癌细胞中高表达，如胃癌、胰腺癌、肺癌等[6,7,8]。目前临床上关于肝癌患者外周血中Midkine和CTCs的表达研究罕见文献报道。本研究通过对Midkine和CTCs在肝细胞癌患者外周血中的表达研究，并分析其与临床病理参数的关系，旨在为肝癌的诊治及预后的判断提供参考依据。

1、资料与方法

1.1一般资料

收集我院2017年3月至2020年3月的原发性肝癌患者临床资料，据影像学或组织学资料，所有患者均符合《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》的诊断标准。收集入组的病例包括患者的性别、年龄、生化指标、血常规和肿瘤情况。纳入标准：术前经CT、MRI、超声造影诊断为肝细胞癌，无肝外转移灶，术后病理证实为肝细胞性肝癌；年龄满18周岁；肝功能Child-pughA-B级。排除标准：其他恶性肿瘤病史；伴有严重的心血管或肾脏疾病；脾脏肿大；接受过肝脏切除或肝移植手术。根据以上标准，本研究共纳入我院96例患者(肝癌组)。男68例，女28例；年龄23～78岁，平均年龄(53.6±12.8)岁；乙肝表面抗原阳性(HBsAg)78例，阴性18例；肿瘤直径1.5～13cm,平均(5.9±1.1)cm;血管侵犯23例，无血管侵犯73例；Child-pughA级52例，B级44例；甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)水平<400ng/mL有55例，≥400ng/mL有41例；BCLC分期0期患者有4例，A期患者有9例，B期患者有40例，C期患者有43例；Edmondson-Steiner分级I级20例，II级36例，III级28例，IV级12例。另选40例健康体检组作为对照组，其中男性24例，女性16例；年龄20～75岁，平均年龄(48.8±12.0)岁。

1.2主要试剂与仪器

Midkine酶联免疫试剂盒购自上海广锐生物有限公司，PBS缓冲液、4%多聚甲醛固定液购自武汉博士德公司，EpCAM抗体磁珠购自美国SantaCruz公司，红细胞裂解液购自广州益善生物技术有限公司，4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)细胞核染料购自美国Sigma公司，CK8、CK18、CK19、CD45探针，twist、vimentin探针购自美国Invitrogen公司。

1.3方法

Midkine检测：两组受试者均采集空腹12h晨间静脉血5mL,加入抗凝剂抗凝，室温下静置30min,3000r/min离心5min,迅速分离血清并置于-80℃冰箱中冻存，采用ELISA和电化学发光法检测血清中Midkine水平，操作步骤严格按照Midkine酶联免疫试剂盒说明书。每个样品做2个复孔，酶标仪上读出450nm波长时各孔的光密度值(OD值)。酶标仪根据平板设置、每孔光密度值以及标准曲线自动计算每孔的浓度，根据标准品精确计算出样品浓度(ng/mL)。

CTCs检测：采用阴性富集法在外周静脉血中筛检CTC,两组受试者均采集空腹12h晨间静脉血5mL置于ACD抗凝管中，裂解液去除红细胞，EpCAM抗体磁珠孵育混匀去除白细胞，分离液分离富集的CTCs。通过多重mRNA原位杂交技术分析，使用PE标记的CK8、CK18、CK19、twist、vimentin抗体和肿瘤抑制基因APC标记的CD45抗体对样本细胞进行染色，DAPI核染后，通过半自动四色荧光显微镜进行分析。

免疫荧光法染色：将干燥好的标本固定、老化、脱水处理，在每个标本区加入10μL已混匀的CEP8探针，盖上盖玻片。吸取RubberCement200～300μL,完全封住盖玻片边缘进行杂交：变性76℃,5min;杂交37℃,1.5h后洗片。取出标本，去掉盖玻片，按每人份20μLCD45-AF594荧光抗体、180μL2%BSA溶液的比例配制抗体工作液，避光待用。用0.2%BSA溶液洗标本区2次，每次500μL。吸去标本区上的BSA溶液，将配置好的CD45抗体加至标本区，室温并避光孵育1h。将DAPI管离心(1000r/min)后，液面处取10μLDAPI染液，加至标本区，盖上盖玻片，荧光显微镜下读片。

CTCs阳性判定标准：(1)单个细胞，核质均匀，未发现分层。(2)信号3个或3个以上，且在细胞核上。(3)红色通道下未见CD45显色。(4)细胞表面无磁珠。细胞数1个即视为CTC阳性。本实验中上皮型CTCs为CK8(+)、CK18(+)、CK19(+)、EpCAM(+)、CD45(-),荧光显微镜下检测为红色荧光信号点。间质型CTCs为twist(+)、vimentin(+)、CD45(-),荧光显微镜下检测为绿色荧光点。混合型CTCs为同时表达上皮型和间质型，荧光显微镜下检测为红色或绿色荧光信号点。荧光显微镜下CTCs分型见图1。在外周血检测到CTCs数量3个/5mL为阳性。

1.4观察指标

统计Midkine、CTCs及CTCs各亚型在肝细胞癌患者外周血中的表达。分析Midkine、CTCs在肝细胞癌患者外周血中的表达与临床病理参数之间的关系以及肝细胞癌患者外周血Midkine表达与CTCs表达的相关性。

1.5统计学方法

应用SPSS22.0软件进行数据分析，计量资料中符合正态分布的以均数±标准差(x¯±s)表示，两组间采用独立样本t检验；非正态分布以中位数表示，组间比较采用秩和检验。计数资料以百分比表示，采用χ2检验。Midkine和CTCs表达的相关性分析采用Spearman相关系数法。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1外周血中Midkine表达

肝癌组外周血中Midkine的表达水平为1.25(0.85～1.41)ng/mL,显著高于对照组外周血中Midkine的表达水平0.16(0.06～0.22)ng/mL(P<0.001),见图2。

2.2外周血中CTCs表达

对照组外周血中CTCs阳性检出率为7.5%(3/40);肝癌组外周血中CTCs阳性检出率为70.8%(68/96),其中检测出上皮型CTCs阳性率为31.3%(30/96),间质型CTCs阳性率为44.8%(43/96),混合型CTCs阳性率为67.7%(65/96);肝癌组外周血中CTCs阳性率高于对照组，差异有统计学意义(χ2=56.855,P<0.001)。

2.3肝癌患者外周血中Midkine表达与临床病理特征的关系

肝癌患者外周血中Midkine表达在性别、年龄、HBsAg表达上均无显著差异(P>0.05);在肿瘤大小、血管侵犯、Child-pugh分级、AFP水平、BCLC分期及Edmondson-Steiner分级均有显著差异(P<0.05),见表1。

2.4肝癌患者外周血中CTCs表达与临床病理特征的关系

肝癌患者外周血中CTCs表达在年龄、性别、肿瘤大小、HBsAg表达上均无差异(P>0.05);在血管侵犯、Child-pugh分级、AFP水平、BCLC分期及Edmondson-Steiner分级均有显著差异(P<0.05),见表2。

2.5CTCs阳性患者亚型与临床病理特征的关系

CTCs阳性患者三种类型在性别、年龄、Child-pugh分级、HBsAg表达无显著差异(P>0.05);在肿瘤大小、血管侵犯、AFP水平、BCLC分期及Edmondson-Steiner分级均有显著差异(P<0.05),见表3。

2.6外周血中Midkine表达与CTCs表达的相关性

在肝癌患者外周血CTCs表达阴性组，Midkine表达水平为0.40(0.19～0.64)ng/mL,显著低于CTCs表达阳性组时Midkine表达水平1.60(0.89～2.35)ng/mL(P<0.05)。Spearman相关性分析得出，外周血中Midkine表达与CTCs表达呈正相关(r=0.531,P=0.007)。

3、讨论

Midkine是一种分泌型肝素结合生长因子，为低分子量的蛋白质，其在胚胎发育中高表达，出生后Midkine的表达逐渐下降。然而在肿瘤发生、炎症和组织细胞修复过程中其表达明显增强[9]。本研究结果显示，肝癌组外周血Midkine的表达水平显著高于正常组，提示Midkine在肝癌中可能扮演促癌因子的角色。对肝癌患者外周血Midkine表达与患者临床病理特征分析结果发现，外周血Midkine的表达在肿瘤直径、血管侵犯、Child-pugh分级、AFP水平、BCLC分期及Edmondson-Steiner分级均有显著差异。由此推测在肿瘤直径较大、血管受到侵犯、Child-pugh分级较高、AFP水平较高、BCLC分期较晚、Edmondson-Steiner分级较高的肝癌患者中，其外周血Midkine表达水平较高，提示Midkine可能参与了肝癌的发展和转移过程及肿瘤血管生成，因此有望通过Midkine的表达情况推测肝癌患者有无血管侵犯、肿瘤的临床分期及分级情况。

CTCs是恶性实体肿瘤细胞在增殖过程中，随着肿瘤病灶的增大，肿瘤细胞从原发病灶脱落，突破一系列屏障，进而趋化性移动进入淋巴管和血液循环中形成的[10]。有研究认为，CTCs的存在是导致肿瘤侵犯与转移的原因[11]。本研究发现，肝癌患者外周血CTCs在血管侵犯、Child-pugh分级、AFP水平、BCLC分期及Edmondson-Steiner分级均有显著差异，提示外周血CTCs表达与肿瘤进展有关。有研究表明，CTCs计数阳性率在肿瘤分期I、II期显著小于III、IV期[12]。汪宇等[13]研究发现伴有微血管侵犯的肝癌外周血CTCs阳性率高于不伴有微血管侵犯的肝癌患者。结合本研究结果说明CTCs是肝癌进展的一个重要因素。

CTCs具有异质性，肿瘤细胞穿过细胞基膜渗透进入血管成为上皮型CTCs,经过上皮间质转化(EMT)转变为更具侵袭性和游走能力的间质型CTCs。有研究表明，间质型CTCs可抵御失巢凋亡，耐受细胞毒药物，其转移侵袭潜能更高[14]。因此对CTCs进行亚型分析可更准确地评估肿瘤患者复发转移风险。本研究结果显示，96例肝癌患者中，上皮型CTCs阳性率为31.3%,间质型CTCs阳性率为44.8%,混合型CTCs阳性率为67.7%。三种CTCs类型在肿瘤大小、血管侵犯、AFP水平、BCLC分期及Edmondson-Steiner分级均有显著差异，肿瘤越大，AFP水平越高，BCLC分期较晚，Edmondson-Steiner分级较高的患者间质型CTCs阳性率越高，与既往研究一致。提示间质型CTCs可以较好的反应肿瘤的发展转移情况及恶性程度。有研究发现间质型CTCs与肿瘤的侵袭性呈正相关，间质型CTCs比例升高可能是导致肿瘤复发转移的一个重要因素[15],表明CTCs亚型分析具有重要作用。本研究对肝癌患者外周血Midkine表达与CTCs表达进行相关性分析，结果发现在CTCs表达阴性组，Midkine表达水平显著低于CTCs表达阳性组时Midkine表达水平；Spearman相关性分析得出外周血Midkine表达与CTCs表达呈正相关，与报道结果一致。SUN等[16]研究报道，Midkine升高的肝癌患者的CTCs计数升高，凋亡的CTCs减少，肿瘤复发率变高，无复发间隔缩短。该实验通过敲低肝癌细胞中Midkine表达，发现可显著提高失巢凋亡的敏感性，细胞存活率降低，肿瘤发生率显著降低。Midkine在肝癌进展的相关分子机制中起着重要作用，Midkine激活的PI3K/Akt/NF-κB/TrkB信号通路的激活间变性淋巴激酶负责失巢凋亡抵抗[17]。Midkine增强肝癌细胞抵抗失巢凋亡中的作用，从而促进后续转移。推测肝癌细胞中Midkine可能参与失巢凋亡抵抗机制，介导肝癌CTCs在血液循环中存活的调节。提示检测Midkine表达升高与CTC计数升高均是患者预后的不利预测指标。