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基于生物信息学分析乳腺癌组织中Rspo3基因甲基化水平及临床意义

2021-10-12 100 上传者：管理员

摘要：目的:讨论Rspo3基因在乳腺癌组织中的表达情况,启动子甲基化水平及意义。方法:通过TheHumanProteinAtlas分析Rspo3蛋白在乳腺癌组织中的表达情况;利用Oncomine、GEPIA、UALCAN数据库分析Rspo3DNA、mRNA在乳腺癌组织中的表达情况;利用MethHC和UALCAN数据库分析Rspo3基因启动子区域甲基化水平;利用String-DB分析与Rspo3相互作用的蛋白。结果:在蛋白水平上,Rspo3蛋白在乳腺癌组织中较正常乳腺组织低表达,在DNA、mRNA水平上,Rspo3在乳腺癌组织中较正常乳腺组织显著低表达,且其启动子甲基化水平则显著增高。与Rspo3相关蛋白有LGR(4～6)、UBA52、UBB、UBC、Rspo1、Rspo4、ZNRF3、RNF43,可能调节乳腺癌中Wnt/β-catenin信号传导通路的激活。结论:基于现有的肿瘤数据库进行生物信息学分析,可以发现Rspo3在乳腺癌组织中呈低表达,其启动子甲基化水平则表达增高。这为深入研究乳腺癌,并发现新的乳腺肿瘤标志物提供了大样本数据支持。

关键词：
Rspo3
乳腺癌
恶性肿瘤
甲基化
病理分析
血液检查
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乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，在过去的几十年中，乳腺癌的发病率持续上升。2018年，世界范围内大约有210万例新增女性乳腺癌病例，占女性癌症病例总数近1/4[1]。尽管乳腺癌筛查和治疗有所改善，但每年仍有超过50万女性死于乳腺癌，并且其中约90%死于远处转移。乳腺X线检查是目前应用最广泛的乳腺癌筛查方法[2],它可以有效降低50至69岁妇女的乳腺癌死亡率；但是，对40至49岁妇女乳腺癌死亡率的影响尚不明确[3]。此外，假阳性结果及过度诊断还会给病人带来巨大的精神、经济压力。相比之下，血液检查对特定癌症的筛查，可以提高病人的依从性，并且具有较高的诊断价值[4]。因此，发现和筛选新的肿瘤生物标志物对于乳腺癌的预防、诊断和治疗具有重要意义。

基础研究发现表观遗传学改变也可以影响基因的表达，而这与肿瘤的发生、发展也有着密切的关系。如DNA甲基化，具有调节基因表达而不改变DNA序列的能力，但是基因的表达却出现了能够遗传的改变。以往对血浆和血清中DNA甲基化的研究表明，基因特异位点的DNA甲基化可以为乳腺癌筛查提供一个有效的途径[5]。此外，对全血的研究还表明，外周血细胞或白细胞DNA甲基化在预测乳腺癌方面具有潜在的应用价值[6]。

R-spondin(Rspo)蛋白家族由四个成员(Rspo1～4)组成，所有成员均为分泌蛋白，在多个组织中均广泛表达。编码Rspo蛋白的4个基因序列同源性为40%～60%,Rspo蛋白还具有两个furin-like结构域，一个TSP1结构域和一个富含碱性氨基酸的C端结构域[7]。有研究表明Rspo的激活可以替代最常见的突变，能通过促进Wnt信号转导而促进结肠肿瘤的发展，可作为肠道恶性肿瘤的另一驱动因素，而且Rspo3与肿瘤生长的关系最为密切，并提出将Rspo3作为治疗含有Rspo3融合的结直肠癌的候选靶点[8]。除此之外，尚有多篇文献报道了Rspo3基因作为多种癌症新的生物标志物(肺癌、膀胱癌、前列腺癌等)[7,9,10],而在乳腺癌中，Rspo3基因在国内外鲜有报道。

本研究通过分析现有数据库，预测Rspo3基因在乳腺癌中的表达情况，及Rspo3基因启动子区域甲基化水平，并探讨Rspo3基因作为潜在乳腺癌生物标志物的可能性。

1、资料与方法

1.1TheHumanProteinAtlas(HPA)数据库

人类蛋白质表达图谱数据库，致力于提供全部24000种人类蛋白质的组织和细胞分布信息，并免费供公众查询。其是基于免疫组化的方法，可用于正常组织(或细胞系)和肿瘤组织(或细胞系)蛋白差异表达分析。在本研究中，引用网站中组化抗体(No.HPA029957)对正常乳腺组织和乳腺癌组织免疫组化实验。

1.2GEPIA数据库

基因表达谱数据动态分析是由北京大学研制开发的在线应用数据库,用于分析TCGA和GTEx项目中的9736个肿瘤和8587个正常样本的RNA测序表达数据。包含33种恶性肿瘤，用于分析、寻找肿瘤组织和正常组织中差异表达的基因，根据癌症类型或病理分期的分析，患者生存分析，相似基因检测和降维分析[11]。在本文中选择使用TCGA数据库。

1.3Oncomine数据库

Oncomine是目前世界上最大的癌基因芯片数据库和整合数据挖掘平台，旨在比较主要癌症类型和各自正常组织的差异表达分析，也可以用于探索各种癌症亚型以及基于临床和病理学的分析。到目前为止，该数据库已经收集了729个基因表达数据集，90000多个癌症组织和正常组织的样本数据。在本研究中设置的检索条件如下：①Analysistype:“carcinomavsnormalanalysis”;②设定条件：“Under-expression”。从Oncomine数据库中筛选基因，选择Rspo3基因后，设定条件为：“GeneRspo3”,余条件同前。

1.4UALCAN数据库

UALCAN数据库是用于分析癌症转录组数据，旨在提供容易访问的癌症转录组数据(TCGA和MET500转录组测序),并提供使用HPRD、GeneCards、Pubmed、TargetScan和HPA数据库的选定基因的附加信息集(http://ualcan.path.uab.edu)[12]。在本文中使用网站中的TCGA数据，分析Rspo3在乳腺癌中的表达情况。

1.5MethHC数据库

MethHC数据库是基于TCGA公共数据库，探讨DNA甲基化和肿瘤基因表达的综合数据库。其中收录了18种人类癌症的6000多个样本和6548个芯片以及12567个RNA测序数据。在MethHC数据库中，选择“BRCA”,在“genesearch”中输入“Rspo3”,在“generegion”中选择“promoter”。

1.6String-DB数据库

该数据库是分析生物学基因或蛋白相互作用的检索工具，包含已证实的和可以预测的蛋白质-蛋白质相互作用的生物数据库和网络资源。既包括蛋白质之间的直接物理相互作用，也包括蛋白质之间的间接功能相关性。在本研究中输入“Rspo3”,物种类型选择Has(人类)。

2、结果

2.1Rspo3在乳腺癌组织中的表达情况

2.1.1HPA数据库分析Rspo3蛋白在乳腺癌组织中的表达

通过对HPA数据库(No.HPA029957)的搜索，发现正常乳腺组织和乳腺癌组织的对比如图1所示，免疫组化显示Rspo3位于核内，正常乳腺组织染色明显深于乳腺癌组织。由此可以证实Rspo3蛋白在乳腺癌组织中较正常乳腺组织低表达。

2.1.2GEPIA、Oncomine、UALCAN数据库分析Rspo3在乳腺癌组织中的表达

在GEPIA网站中搜索“Rspo3”基因，如图2所示，通过分析Rspo3基因在不同肿瘤中的表达情况，可以发现Rspo3在不同肿瘤中表达并不一致。

利用GEPIA网站中提供的TCGA数据库来源的1376个乳腺样本，其中正常乳腺组织291例，乳腺肿瘤组织1085例。如图3所示，可以发现Rspo3在乳腺癌组织中的表达量明显较正常乳腺组织中低(P<0.05)。

在Oncomine数据库中，选择TCGA数据库，在该数据库中选择DNA数据库，选择表达下调的基因，选择T分期，如图4所示，可以发现随着T分期的增高，Rspo3表达量降低，差异具有显著性(P<0.05)。

在UALCAN数据库中选择BRCA、Rspo3,选择survival。如图5所示，可以发现Rspo3基因的表达与预后相关(P<0.05)。

2.2Rspo3启动子区域DNA甲基化水平分析

在MethHC中，按上述条件搜索，如图6所示，Rspo3有一个转录本(NM_032784),其在乳腺癌组织中甲基化水平明显高于正常组织(P<0.005),并且Rspo3基因的甲基化水平与其表达量成反比。

在UALCAN数据库中选择BRCA、Rspo3,选择Methylation。如图7A所示，也可以发现乳腺癌样本中Rspo3甲基化水平明显高于正常乳腺组织；并且如图7B所示，Rspo3甲基化水平在不同病理类型乳腺癌中也存在差异。

2.3Rspo3相互作用蛋白网络

通过String网站分析发现：Rspo3基因在细胞信号转导通路中处于重要位置，PPI富集P=5.78E-14,节点数为11个，55条相互作用关系。图8所示为与Rspo3有相互作用的蛋白质分子。

3、讨论

在本文中，通过HPA数据库验证了Rspo3在乳腺癌中低表达；通过Oncomine和GEPIA数据库进一步佐证了Rspo3在乳腺癌中的低表达状态；在生存分析中，乳腺癌患者Rspo3基因的表达增加与生存率增加有关。这些结果提示Rspo3可能是一潜在的抑癌基因，是乳腺癌患者一种新的生物标志物和预后因素。

在前列腺癌、膀胱癌、宫颈癌、肺癌、结直肠癌等多种癌症中Rspo3表达水平明显下调，而在卵巢癌和肉瘤中却高表达，这与图2中GEPIA预测内容相一致。这表明Rspo3基因在多种组织中表达，但在时间与空间上均具有差异性，并发挥着不同的作用。

许多研究已经表明，Rspo3通过激活和协同Wnt/β-catenin信号通路在多个细胞过程中起着重要调节作用，包括物质运输、分解代谢、细胞移动、细胞通信、细胞生长和死亡以及肿瘤发生[7]。在肺癌、结直肠癌、卵巢癌、膀胱癌和乳腺癌中均报道过Wnt通路的异常。通常在成熟的正常细胞中Wnt通路一般呈关闭状态，当Wnt通路上信号蛋白发生突变或者异常表达，使Wnt通路激活，从而引起细胞产生异常增殖，并发生向恶性转化的趋势[13]。Wnt通路激活后将分解胞质中β-catenin降解复合体，招募细胞内β-catenin,使其活化后转移入细胞核，并与转录因子LEF/TCF等共同作用激活下游特异靶基因c-Myc、ccNDI、DKKI、WISPI、FGF20等的转录。目前已经有大量研究证明了Wnt/β-catenin信号通路在乳腺癌发生、发展和转移的过程中起着重要作用[14]。

本研究通过MethHC和UALCAN数据库分析可以发现，乳腺癌样本中Rspo3基因启动子甲基化水平明显高于正常乳腺组织，这可能是导致Rspo3在乳腺癌中低表达的原因。此外，在不同病理类型中Rspo3基因启动子甲基化水平存在差异，这种差异的出现导致了各病理类型间预后的明显不同。有研究证实，基因启动子区域的甲基化程度和转录抑制的程度有关，基因的转录可被启动子的甲基化抑制，从而下调或沉默基因的表达[15]。目前，已经建立的血液DNA甲基化标记还不足以诊断早期乳腺癌，但其中一些基因甲基化已经证明了可以为乳腺癌风险分层提供依据[16,17]。这些研究的发现为探讨乳腺癌发生机制提供了新的方向。因此，本文关于Rspo3甲基化异常的研究还需要在前瞻性、高质量的临床试验中加以验证，并需要使用精确、定量的方法在大规模筛选人群中进行测试来进一步探究Rspo3甲基化作为乳腺癌潜在诊断标志物的敏感性与特异性。当应用于足够大的研究样本时，用于表观基因组DNA甲基化分析的先进技术将有助于识别真正相关的甲基化标记并为乳腺癌提供风险评估。并且与多基因风险评分相结合，可以提供更准确的风险预测，有助于识别乳腺癌高危人群，从而提供个体化、精准化的筛查方案。