2021年，全球新发癌症病例约1 929万例，肝癌91万例，占新发癌症总数的4.7%,癌症死亡病例996万例，肝癌83万例，占癌症死亡总数的8.3%[1],肝癌死亡病例数占肝癌发病数的91.2%。可见肝癌死亡率很高。因此，在现有治疗手段的基础上探索其他治疗肝癌的方法对于肝癌患者具有重要意义。

钙调蛋白磷酸酶(CaN)是一种真核钙离子和钙调蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。它是一种异二聚体蛋白，由一个催化亚基钙调神经磷酸酶A和一个紧密结合的豆蔻酰化钙离子结合亚基钙调神经磷酸酶B组成，后者包含一个活性位点双核金属中心[2,3]。其中，A亚基为催化亚基，分子量为60～61 kD;B亚基为调节亚基，编码基因位于2号染色体，分子量为19.3 kD,含有4个Ca2+结合位点[4,5],主要分布于细胞的质膜、胞浆、细胞核、胞外、细胞骨架和线粒体。研究表明，外源性rhCNB可以通过网络蛋白依赖性受体介导的内化，并以时间和浓度依赖性的方式被细胞吸收到许多不同的肿瘤细胞中发挥抗肿瘤作用[6]。前期预实验重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基(recombinant human calcineurin subunit B,rhCNB)能有效抑制肝癌细胞及其实体瘤的生长，对正常肝细胞无抑制作用，但其肝癌靶向性尚需进一步研究。

本研究先用FITC荧光标记rhCNB并建立BALB/c裸小鼠荷人肝癌细胞SMMC-7721原位肝癌模型，运用小动物活体成像系统检测rhCNB不同时间点在荷瘤小鼠体内的分部情况，为rhCNB的肿瘤靶向性研究及其评价提供依据。

1、材料与方法

1.1实验材料

rhCNB,由海口奇力制药有限公司提供；FITC标记的rhCNB(rhCNB-FITC),代号：2483-蛋白-FITC,规格：1 mL/瓶，保存条件：-80℃避光长期保存，厂家：上海友科生物科技有限公司；FITC对照品，规格：1 mL/瓶，保存条件：-80℃避光长期保存，厂家：上海友科生物科技有限公司；肿瘤细胞株，人肝癌细胞SMMC-7721,购于中国科学院上海细胞库；RPMI 1640培养基、胰蛋白酶、胎牛血清购自美国Gibco公司。

1.2实验动物及饲养条件

42只SPF级BALB/c裸小鼠，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验时体重18～22 g,性别均为雄性。实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2016-0002,实验动物质量合格证：No.43004700035420,实验动物使用许可证号：SYXK(琼)2017-0013。实验动物饲养的环境条件符合国家标准(GB14925-2010)对SPF级实验动物环境条件的要求。实验室温度为20℃～26℃,最大日温差/℃≤4,相对湿度为40%～70%,最小换气次数≥15(次/h),空气洁净度为7级，相同区域的最小压差≥10 Pa,沉降菌最大平均浓度≤3(CFU/0.5 h·Φ90 mm平皿),氨浓度≤14 mg/m3,噪声不高于60 dB,动物照度为15～20 lx。

1.3方法

1.3.1细胞混悬液法建立BALB/c裸小鼠皮下移植瘤模型

肿瘤细胞体外常规培养至对数生长期(刚复苏的细胞应传代2次以上),消化离心脏后制成浓度约1×107个细胞/mL的细胞混悬液，0.1 mL/只接种于小鼠右侧腋窝皮下。注射完后应用干净的干棉签按压针眼至无细胞混悬液溢出。

1.3.2建立BALB/c裸小鼠肝癌原位移植瘤模型[7]7]

取生长良好的皮下移植瘤，用眼科剪剪成大小约为2 mm×2 mm×2 mm的肿瘤组织块备用。实验采用Matrx VIP 3000型气体麻醉系统对实验动物进行气体麻醉，麻醉剂为异氟烷。动物麻醉后，取仰卧位，用组织剪逐层剪开皮肤，开口长度约为1 cm,暴露出肝脏。先用带缝合线的缝合针(4×10)穿过肿瘤组织，再从肝右叶内测穿至外侧，然后打一个手术结，轻轻拉紧，剪断手术线即可。这样肿瘤组织刚好可以夹在肝右叶和肝左叶之间，不会与其它组织黏连，最后逐层缝合好腹腔，创口消毒，小心饲养。

1.3.3动物分组

分别取原位接种人肝癌细胞SMMC-7721的BALB/c裸小鼠24只，按体重序随机分为FITC标记的rhCNB给药组和FITC对照组，每组12只，其中6只在给药后2 h进行荧光检测，剩余6只在给药后24 h进行荧光检测。另取18只未接种肿瘤的正常BALB/c裸小鼠，12只给予FITC标记的rhCNB,其中6只在给药后2 h进行荧光检测，6只在给药后24 h进行荧光检测，6只不给药作为正常对照。

1.3.4给药剂量、给药体积和给药浓度

FITC标记的rhCNB-FITC样品中rhCNB浓度为0.2 mg/mL,给药体积为10 mL/kg,因此，给药剂量为2 mg/kg。其中，FITC的浓度为0.34 mg/mL(389.38 g/M×8.71×10-4 M≈0.34 mg, 0.34 mg÷1 mL =0.34 mg/mL),给药剂量为3.4 mg/kg;阳性对照品中FITC的浓度为0.31 mg/mL(389.38 g/M×8.07×10-4 M≈0.31 mg, 0.31 mg÷1 mL= 0.31 mg/mL)。为了使阳性对照给予的FITC剂量与供试品一致，在不改变其浓度的条件下只有增加给药体积，给药体积为3.4 mg/kg÷0.31 mg/mL≈10.97 mL/kg。

1.3.5给药途径和给药频率

rhCNB-FITC给药组和FITC对照组尾静脉注射给药，给药1次。

1.3.6检测指标

用小动物活体成像系统对荷瘤BALB/c裸小鼠心脏、肺、肝(含肿瘤)、胃、双侧肾脏和脾脏进行FITC荧光发光值检测，分析FITC标记的rhCNB是否靶向作用于肿瘤部位。如果供试品FITC标记的rhCNB给药组在肿瘤部位检测到的荧光发光值强于FITC阳性对照组动物肿瘤部位的荧光发光值，则说明rhCNB在肿瘤部位具有靶向聚集作用。 所得数据用SPSS统计软件进行分析。

1.3.7统计学分析

采用SPSS 27.0统计分析软件进行统计分析，结果以x¯±s表示，各组间的差异采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义，P<0.01为差异具有显著统计学意义。

2、结果

2.1正常BALB/c裸小鼠的心、肺、肝、胃、双侧肾脏和脾脏部位的荧光值检测

对未接种正常动物组小鼠心脏、肺、肝、胃、双侧肾脏和脾脏荧光检测，当最小值(Min)调至5×108时，所有动物除胃(内容物)以外，均未见明显荧光信号(图1)。

图1正常BALB/c裸小鼠主要生命器官荧光图  

A-C:胃部所检测到的荧光为胃内容物所产生的荧光。

2.2正常BALB/c裸小鼠给予rhCNB-FITC后各主要器官的荧光值检测

rhCNB-FITC给予未接种肿瘤的正常BALB/c裸小鼠后2 h、24 h,剖检取出心脏、肺、肝、胃、双侧肾脏和脾脏，用小动物活体成像系统进行荧光检测。结果表明，rhCNB-FITC给予未接种肿瘤的正常动物2 h时，主要分布于动物的肾脏、肝脏、胃、心脏和肺，脾脏未见明显分布(表1、图2A-B)。rhCNB-FITC给予正常动物24 h时，主要分布于动物的肾脏，荧光值为4.15E+09±2.28E+09,肝、胃、心、肺和脾脏未见明显分布(图2C)。说明通过尾静脉注射进入动物体内的绝大部分rhCNB能在24 h内通过肾脏代谢。

表1正常BALB/c裸小鼠给予rhCNB-FITC 2 h时的组织器官荧光强度(x¯±s,[p/s]/[μW/cm2])

注：n为动物数，“/”后的数字为动物总数，“/”前的数字为检测到相应脏器荧光值的动物数。“-”表示未检测到明显的荧光信号。“肝”和“胃”已减去空白对照组动物肝脏和胃(包括内容物)的平均荧光值。

2.3 rhCNB在人肝癌细胞SMMC-7721原位移植瘤模型动物肿瘤部位的聚集

rhCNB-FITC给药组和FITC阳性对照组动物分别在给予rhCNB-FITC和FITC后2 h、24 h,剖检取出心脏、肺、肝、胃、双侧肾脏和脾脏，用小动物活体成像系统进行荧光检测。

从表2可以看出，在原位肝癌模型试验中，rhCNB-FITC给药2 h时，主要分布于肝、肾脏、肺、胃和心脏等组织器官，脾脏内未检测到明显荧光。FITC给药组只有在肝和胃组织中能检测到荧光，而且荧光强度明显弱于rhCNB-FITC给药组。rhCNB-FITC给药组与FITC对照组肝部(包括正常组织和肝肿瘤组织)的荧光强度比较，P<0.01,具有显著统计学意义。原位肝癌模型组动物给予rhCNB-FITC与未接种肝肿瘤的正常组动物给予rhCNB-FITC比较，P<0.05,具有统计学意义。说明rhCNB在肝肿瘤部位有明显聚集，即对肝肿瘤具有较强的靶向性。

从表3可以看出，rhCNB-FITC给药24 h时，主要聚集在肝、胃、肾脏和肺等组织器官。6只动物的肝肿瘤和胃部均能检测到明显荧光，2只动物的肺部能检测到明显荧光，5只动物的肾脏能检测到明显荧光，脾脏内未检测到明显荧光。FITC在3只动物的肝脏和4只动物的胃部能检测到明显荧光，而且荧光强度弱于rhCNB-FITC。rhCNB-FITC给药组与FITC对照组肝肿瘤部的荧光强度比较，P<0.05,具有统计学意义。而且，未接种肿瘤的正常动物在给予rhCNB-FITC给药24 h时，肝脏内已未能检测到明显荧光。说明rhCNB在原位肝癌动物模型中，24 h时主要聚集在肝肿瘤部位。

rhCNB-FITC给药2 h时，肾脏内的荧光强度(即药物浓度)最高，说明rhCNB在体内可能主要通过肾脏排泄。其次是肝肿瘤、胃和肺。其中，肝脏的荧光强度主要集中在肝肿瘤组织部位，且明显强于FITC对照组肝肿瘤组织和正常肝组织(图2D-E)。说明rhCNB给予原位肝癌荷瘤动物后2 h,在肝肿瘤部位有大量聚集，即对肝肿瘤具有较强的靶向性。rhCNB-FITC给药24 h时，肝肿瘤组织部位的荧光强度(即药物浓度)最高，其次胃和肾脏(图2F)。正常肝组织部位未见明显荧光。说明rhCNB给予荷瘤动物后24 h,在肝肿瘤部位仍然有大量聚集，即对肝肿瘤具有较强的靶向性。

图2 rhCNB在实验动物各主要生命器官的分布及肿瘤靶向 

A、D:正常动物和原位肝癌荷瘤动物心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和胃的剖检图；B:正常动物分别给予rhCNB-FITC和FITC后2 h荧光图；C:正常动物分别给予rhCNB-FITC和FITC后24 h荧光图；E:原位肝癌荷瘤动物分别给予rhCNB-FITC和FITC后2 h荧光图；F:原位肝癌荷瘤动物分别给予rhCNB-FITC和FITC后24 h荧光图。

表2原位肝癌小鼠模型给予rhCNB-FITC和FITC 2 h的组织器官荧光强度(x¯±s) 

注：“**”表示rhCNB-FITC给药组与FITC对照组肝部(包括正常组织和肝肿瘤组织)比较，P=0.002<0.01,具有显著统计学意义。“△”表示原位肝癌模型组动物给予rhCNB-FITC与未接种肝肿瘤的正常组动物给予rhCNB-FITC比较，P=0.014<0.05,具有统计学意义。“n”为动物数，“/”后的数字为动物总数，“/”前的数字为检测到相应脏器荧光值的动物数。“-”表示未检测到明显的荧光信号。“肝”和“胃”已减去空白对照组动物肝脏和胃(包括内容物)的平均荧光值。

表3原位肝癌小鼠模型给予rhCNB-FITC和FITC 24 h的组织器官荧光强度(x¯±s)

注：“*”表示rhCNB-FITC给药组与FITC对照组肝部(包括正常组织和肝肿瘤组织)比较，P=0.033<0.05,具有统计学意义。

3、讨论

CaN被细胞内钙浓度增加激活[8],与钙调蛋白激活的激酶[9]一起，CaN直接将钙信号传导与蛋白质磷酸化状态联系起来，并在许多信号传导过程中发挥重要作用[10]。CaN存在于真核生物中，从单细胞生物到人都较为保守[11]。研究表明，rhCNB能对肝癌、胃癌和肺癌等多种肿瘤起抑制作用[12,13,14],但对肿瘤的靶向研究甚少。本文通过FITC标记的rhCNB和原位肝癌荷瘤小鼠模型，利用小动物活体成像系统对rhCNB的肝癌靶向性进行了系统分析，结果表明，rhCNB具有良好的肝癌靶向性，24 h时主要聚集在肝肿瘤部位。2019年1月，国家药品监督管理局受理rhCNB的临床试验申请(治疗用生物制品1类),同年4月获得临床试验默示许可，本研究为rhCNB临床前试验内容之一。

由于动物的皮肤、毛、胃内容物、胆汁、肠道微生物和饲料等在与FITC荧光染料相同的激发光和发射光波长范围内都能产生相对较强的荧光。而且检测到的荧光强弱还与发光部位的厚度有关，即与荧光穿透相关。比如活体检测时，检测到的小鼠体表组织的荧光要强于内部组织。药物从尾静脉注射进入动物体内后，荧光物质较为分散，此时也无法看到药物的聚集现象。

接种肝癌模型的FITC标记的rhCNB给药组和FITC对照组活体动物在当前给药剂量、给药浓度和给药体积下均无法检测到药物在肿瘤部位的聚集作用。给药后5 min和2 h时，供试品组和对照组活体动物体表荧光强度较为接近，无明显差异。给药后24 h时，供试品组的体表荧光要明显强于阳性对照组动物，这可能与供试品在表浅组织(如淋巴组织)的分布有关。但此时仍然无法检测到药物在肿瘤部位的聚集情况。因此，为了查清药物在动物各重要组织器官的分布和聚集情况，将动物剖检，取出其心、肺、肝、胃、双侧肾脏和脾脏，再用小动物活体成像系统进行检测，这样能更加直观和准确的检测药物在上述主要生命器官及肿瘤部位的聚集情况。

由于动物的组织、胃肠道内容物和饲料在与FITC荧光染料相同的激发光和发射光波长范围内都等产生相对较强的荧光。因此，对未接种正常动物组1～6号动物心脏、肺、肝、胃、双侧肾脏和脾脏荧光检测，当最小值(Min)调至5×108时，所有动物除胃(内容物)以外，均未见明显荧光信号。计算出空白对照组动物胃(包括内容物)的荧光值，在计算FITC标记的rhCNB给药组和FITC对照组的胃(包括内容物)和肝脏的荧光值时，应减去空白对照组动物胃(包括内容物)和肝脏的平均荧光值。

参考文献:

[7]田树红,王日超,邢桂兰,等.裸小鼠肝癌原位移植模型的建立[J].中国实验动物学报,2016, 24(03 ):239-242,247.1

基金资助:海南省自然科学基金资助项目(编号:818MS068);

文章来源:韩丽芳,田树红.钙调蛋白磷酸酶B亚基靶向肝癌的研究[J].现代肿瘤医学,2023,31(18):3342-3346.