氧含量能够影响肝癌对化疗药物的治疗敏感性，如乏氧常使肝癌细胞进入休眠状态(G0期),逃避化疗药物杀伤作用，从而降低化疗敏感性[1];而高氧曾被认为有望提高肝癌患者对化疗药物的治疗敏感性，但高氧同时促进肿瘤细胞增殖等副作用严重限制了其在临床的应用与推广[2]。因此，从更深层次认识氧含量对肝癌细胞化疗敏感性的影响意义深远。小泛素相关修饰蛋白(small ubiquitin-related modifier, SUMO)介导的蛋白质SUMO化修饰形式是机体细胞相应内、外部环境做出的适应性反应[3]。已有研究报道，乏氧能够显著增加神经元中蛋白质SUMO化修饰产物，借此增加神经元对乏氧的耐受[4]。但目前鲜有关于氧含量对肝癌细胞中蛋白质SUMO化修饰水平影响的报道。因此本研究将首先关注不同氧含量(从乏氧到高氧)对肝癌细胞中蛋白质SUMO化修饰水平的影响，并同时就部分已明确的与肝癌化疗抵抗相关的SUMO化靶蛋白的表达进行检测，最终观察氧含量对肝癌化疗药物敏感性的影响。本研究成果能帮 助临床医师从新的角度解读乏氧致肝癌化疗抵抗的分子机制，也将可能为高氧暴露增加肝癌化疗敏感性的治疗方案提供新的思考点。

1、材料与方法

1.1 细胞与试剂

人源性肝癌细胞株Hep3B购自美国模式培养物集存库，胎牛血清、达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified eagle's medium, DMEM)及胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；SUMO1、SUMO2/3、性别决定区Y-box2(sex-determining region Y-box2,Sox2)、八聚体结合转录因子-4(octamer-binding transcription factor 4,Oct4)和β-actin抗体购自美国Abcam公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT]试剂盒购自北京鼎国公司；酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 试剂盒购自赛默飞世尔科技 (中国)有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京Solarbio公司；顺铂购于山东齐鲁制药。

1.2 细胞培养与不同浓度氧暴露

人源性肝癌细胞株Hep3B培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，细胞培养箱内环境条件为37 ℃、5%CO2,且饱和湿度。每3 d使用0.25%胰蛋白酶进行常规细胞消化，并按1∶3比例传代。然后将细胞融合度接近50%的Hep3B细胞进行如下处理：①分别置于氧含量为1%、5%、21%、40%和60%的三气培养箱中48 h, 用于检测不同梯度氧含量对肝癌细胞中蛋白质SUMO化修饰产物的影响；②置于氧含量为1%的 三气培养箱中分别作用 0 h、24 h、48 h、72 h和96 h, 用于检测不同乏氧作用时间对肝癌细胞中蛋白质SUMO化修饰产物的影响；③置于氧含量为60%的三气培养箱中分别作用0 h、24 h、48 h、72 h和96 h, 用于检测不同高氧作用时间对肝癌细胞中蛋白质SUMO化修饰产物的影响。三气培养箱中将O2、N2和CO2按照所需氧含量进行调试通气。

1.3 Western Blot实验

按照上述实验分组开展相关实验，并根据细胞被作用时间提取细胞总蛋白，Bradford法蛋白定 量后，以8%分离胶进行电泳，冰浴下80 V转膜60 min, 脱脂奶粉封闭60 min, 然后分别加入SUMO1(1∶2 000)、SUMO2/3(1∶5 000)、Sox2(1∶2 000)、Oct4(1∶1 000)和β-actin(1∶200)抗体，放置水平摇床在4 ℃环境中孵育过夜，次日使用1∶500稀释的对应二抗孵育1 h; 然后使用超信号蛋白检测试剂盒检测蛋白表达，凝胶成像系统扫描光密度值，Image J 1.8.0软件进行定量分析。

1.4 肿瘤细胞克隆球形成率

常规胰酶消化细胞至单细胞悬液，细胞计数仪下将细胞密度调至约4个细胞/mL,然后将其接种到96孔板中，每孔接 种250 μL,确保每个孔中1个 细胞，培养于含1×B27、20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和20 ng/mL表皮生长因子的DMEM/F12培养基中，并调节培养箱 氧含量分别为1%、21%和60%。7 d后倒置显微镜下计数细胞克隆球形成率。

1.5 MTT细胞毒性实验

在含10%胎 牛血清的DMEM培养基 中加入终浓度为0.4、2、10、50和250 μg/mL的 顺铂，将Hep3B细胞悬液密度 调至约104个细胞/mL,接种到96孔板中，每孔终体积为250 μL,然后分别置于氧含量为1%、21%和60%的三气培养箱中，48 h后行MTT检测分析。酶标仪测定光吸收值(波长490 nm),绘制细胞生长曲线，计算半数抑制浓度(median inhibition concentration, IC50)。

1.6 ELISA实验

在含10%胎 牛血清的DMEM培养基中 加入终浓度为50 μg/mL的顺铂，将Hep3B细胞悬液接种到96孔板中，每孔终体积为250 μL,然后分别置于氧含 量为1%、21%和60%的三气培养箱中，收 集培养 48 h细胞进行低温超声处理，然后以12 000 r/min离心10 min。根据说明书，使用基于ELISA的LDH活性测定试剂盒测量条件培养基中的LDH含量。

1.7 流式细胞凋亡实验

在含10%胎 牛血清的DMEM培养基 中加入终浓度为50 μg/mL的顺铂，将Hep3B细胞悬液接种到直径为6 cm的细胞培养皿中，然后分别置于氧含量为1%、21%和60%的三气培养箱中，48 h后对细胞进行流式细胞凋亡检测。首先将单细胞悬液重 悬于结合缓 冲液中，在100 μL溶液中加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI,在暗盒中室温孵育15 min。详细步骤参见Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒。流式细胞凋亡检测由国家纳米技术与工程研究院协助完成。所有实验在细胞固定后2 h内完成。

1.8 统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件，均数数值以(x¯±s)

表示，三组及三组以上计量资料采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 氧含量对SUMO1和SUMO2/3共价结合产物的影响

如图1所示，Western Blot结果显示Hep3B细胞在不同氧含量条件下处理48 h后SUMO1共价结合产物的水平没有显著差异(P>0.05);然而SUMO2/3共价结合产物在乏氧条件下(氧含量1%和5%)水平显著高于常氧条件(氧含量21%)(P<0.05),随着氧含量的逐渐增高(氧含量40%和60%),SUMO2/3共价结合产物水平进一步下降(P<0.05)。

图1 Western Blot方法检测氧含量对SUMO1和SUMO2/3共价结合产物的影响   

2.2 乏氧暴露时间对SUMO1和SUMO2/3共价结合产物的影响

如图2所示，Western Blot结果显示Hep3B细胞在乏氧处理不同时间后SUMO1共价结合产物的水平没有显著差异(P>0.05);但SUMO2/3共价结合产物在乏氧(氧含量1%)24 h时即出现明显的高表达，此后至本实验所检测的第96 h一直持续在较高水平(P<0.05)。

图2 Western Blot方法检测乏氧对SUMO1和SUMO2/3共价结合产物的影响   

2.3 高氧暴露时间对SUMO1和SUMO2/3共价结合产物的影响

如图3所示，Western Blot结果显示Hep3B细胞在高氧处理不同时间后SUMO1共价结合产物的水平没有显著差异(P>0.05);但SUMO2/3共价结合产物在高氧(氧含量60%)24 h时即出现轻微的升高，此后呈现逐渐下降趋势。

图3 Western Blot方法检测高氧暴露对SUMO1和SUMO2/3共价结合产物的影响   

2.4 氧含量对肝癌细胞克隆球形成能力的影响

如图4所示，Hep3B细胞在乏氧条件下(氧含量1%)细胞克隆球形成率为(34.25±5.64)%;在常氧条件下(氧含量21%)细胞克隆球形成率为(19.44±4.97)%;在高氧条件下(氧含量60%)细胞克隆球形成率仅为(4.16±0.72)%。三组间比较具有统计学差异(χ2=11.14, P<0.05)。

2.5 氧含量对肝癌细胞干性维持蛋白Oct4和Sox2的影响

如图5所示，Western Blot结果显示Hep3B细胞在乏氧条件下Oct4和Sox2的相对蛋白表达量分别为1.07±0.21和0.89±0.23;在常氧条件下二者的相对蛋白表达量分别为0.51±0.17和0.59±0.13;在高氧条件下Oct4和Sox2的相对蛋白表达水平分别为0.27±0.11和0.30±0.12。三组间比较具有统计学差异(Oct4:χ2=12.64,P<0.05;Sox2:χ2=14.31,P<0.05)。

图4 氧含量对肝癌细胞克隆球形成能力的影响   

图5 Western Blot方法检测氧含量对肝癌细胞干性维持蛋白Oct4和Sox2的影响   

2.6 氧含量使肝癌细胞对顺铂治疗IC50的影响

如图6所示，MTT细胞毒性实验结果显示，乏氧组Hep3B肝癌细胞接受顺铂治疗后的IC50为(87.41±6.05)μg/mL,常氧组的IC50为(52.47±6.04)μg/mL,高氧组的IC50为(40.41±5.12)μg/mL。三组间比较具有统计学差异(P<0.05)。

图6 MTT细胞毒性实验检测顺铂对Hep3B肝癌细胞的抑制率   

2.7 氧含量使肝癌细胞对顺铂治疗后LDH含量的影响

如图7所示，ELISA实验检测结果显示，乏氧组Hep3B肝癌 细胞接受顺铂治疗后 的LDH含量为(57.31±5.19)ng/mL,常氧组的LDH含量为(77.49±6.31)ng/mL,高氧组的LDH含量为(154.93±8.64)ng/mL。三组间比较具有统计学差异(P<0.05)。

2.8 氧含量使肝癌细胞对顺铂治疗后细胞凋亡的影响

如图8所示，Q1区为死亡细胞，Q2区为中晚期凋亡细胞，Q3区为早期凋亡细胞，Q4区为活细胞。流式细胞术实验检测结果显示，乏氧组Hep3B肝癌细胞接受顺铂治疗后的细胞死亡率(Q1区)+细胞凋亡率(Q2区+Q3区)之和为(7.46±0.74)%,常氧组 为(18.41±2.17)%, 高氧组为(25.43±2.97)%。三组间比较具 有统计学差异(χ2=11.02,P<0.05)。

图7 氧含量使肝癌细胞对顺铂治疗后LDH含量的影响   

图8 流式细胞术检测细胞凋亡情况   

3、讨论

氧含量对于肝癌的生长与治疗均具有举足轻重的作用。在肿瘤生长方面，富氧环境能够促进肝癌细胞增殖[5]。但在实际机体内，由于肿瘤细胞的快速增殖，常使得肿瘤新生血管生成速度跟不上肿瘤自身生长，而致大部分肿瘤细胞处于相对缺氧环境[6,7]。肿瘤细胞为了适应缺氧，一方面减缓自身细胞增殖周期，甚至进入休眠状态(G0期),从而逃避常规放、化疗作用，成为肝癌放、化疗抵抗的重要原因之一[8];另一方面，肿瘤细胞为了寻找更适宜的生长环境，使得自身变得更具侵袭性和转移性[9]。基于以上原因，科研工作者曾试图通过高浓度氧治疗增加肝癌对放、化疗的敏感性，但是由于高氧促进肿瘤增殖的明确副作用而使其始终未能得到临床医师的广泛认可和推广应用[10]。因此，在高浓度氧治疗肝癌方面，如何在增加肿瘤细胞化疗药物敏感性的同时，最大程度地降低其治疗副作用，仍是目前关注的焦点问题之一，这也依赖于人们在分子机制层面不断加深对氧含量对肝癌影响的再认识。

SUMOs是一类结构与泛素相似但功能迥异的小分子蛋白。目前在哺乳动物体内共发现五种SUMO变构体，其中SUMO4和SUMO5由于其高度的组织特异性和人们对其认知的缺乏[11],目前相关研究报道极少。与SUMO4和SUMO5相比，SUMO1、SUMO2和SUMO3广泛存在于机体几乎所有组织和细胞类型中，参与氧化应激、细胞增殖与代谢、细胞周期调节、转录因子转录与翻译后修饰等多种事件的各个环节，并在过去十年间被研究者广泛解读，获得了一系列极具转化价值的科研成果[12,13]。比如，研究者发现，一般情况下，SUMO1多参与细胞迟发性反应，而SUMO2/3则主要参与细胞急性应激反应[14]。此外，由于SUMO2和SUMO3结构上的高度相似性以及功能上的高度重叠性，使得科研工作者常将SUMO2与SUMO3结合在一起进行研究，并通常写作为SUMO2/3[15]。有研究表明，神经元作为一种对氧含量高度敏感的细胞类型，主要通过其对蛋白质SUMO化修饰的调节来拮抗乏氧不利微环境，是神经细胞响应乏氧时的一种重要自我保护机制[4]。基于以上认识，我们推测，不同氧含量可能会引起肝癌细胞中蛋白质SUMO化修饰的广泛变化，并介导肝癌对放、化疗的敏感性。

本研究首先将人源性肝癌细胞株Hep3B置于梯度氧含量环境中进行培养。由于大部分肝癌细胞所处的乏氧环境均低于5%,甚至在部分区域接近0.1%[16],因此本研究选择以1%和5%两个氧含量作为乏氧条件展开研究。而在临床工作中，人们在应用高浓度氧治疗时，更容易接受低等浓度(21%～40%)和中等浓度(41%～60%),而对更高浓度氧疗(>60%)则始终持一种保守态度[17]。因此，本研究选择将40%和60%两个氧含量作为高氧条件加以研究。本研究的结果显示，乏氧与高氧均未对SUMO1共价结合产物产生明显的影响，这与SUMO1多参与细胞迟发性反应的机理是相吻合的；但是不同氧含量对SUMO2/3共价结合产物产生了明显的影响，主要表现为：①随着氧含量的升高，Hep3B细胞中SUMO2/3共价结合产物水平逐级下降；②当将Hep3B细胞置于乏氧环境不同作用时间时，Hep3B细胞中SUMO2/3共价结合产物在本实验第一个测试时间点(24 h)即出现了显著的升高，较0 h时升高了至少4倍，此后至第二个测试时间点(48 h)达到了峰值，较0 h时升高了约5倍，并在接下来的测试时间点(48 h～96 h)始终维持峰值水平；③当将Hep3B细胞置于高氧环境不同作用时间时，Hep3B细胞中SUMO2/3共价结合产物水平在本实验第一个测试时间点(24 h)出现了轻微的升高，较0 h时升高了约1.5倍，此后至第二个测试时间点(48 h)恢复到了0 h水平，并在接下来的测试时间点(48 h～96 h)逐级下降。我们推测高氧作为一种特殊的氧化应激刺激，在早期可引起SUMO2/3共价产物的一过性升高，此后在高氧持续作用下，逐渐发生了去SUMO化修饰，降低了SUMO2/3共价结合产物水平。总的趋势是，乏氧显著提升SUMO2/3共价结合产物水平，而长时间高氧暴露能够降低SUMO2/3共价结合产物水平。

由于化疗敏感性与肿瘤细胞干性密切相关，而参与肿瘤细胞干性维持的两个重要蛋白Oct4和Sox2均被报道是SUMO的靶调节蛋白[18,19],因此本研究接下来检测了氧含量对Oct4和Sox2蛋白表达的影响。结果显示乏氧能够增加Oct4和Sox2的蛋白表达水平，而高氧能够降低Oct4和Sox2的蛋白表达。该结果提示乏氧能够增加肝癌细胞的干性潜能，而高氧则可以降低其干性潜能。该结论也被进一步的细胞克隆球形成实验结果所证实，即乏氧能够增加肝癌细胞克隆球形成率，而高氧降低其克隆球形成率。接下来我们检测了氧含量对肝癌细胞化疗药物敏感性的影响。结果显示，乏氧能够降低Hep3B细胞对顺铂的化疗敏感性，而高氧能够提高Hep3B细胞对顺铂的化疗敏感性。

总之，通过本研究我们发现乏氧可以通过特异性地提升SUMO2/3水平，而非SUMO1的共价结合产物增加肝癌细胞干性维持潜能，进而参与其化疗抵抗机理；而高氧能够降低SUMO2/3共价结合产物水平，降低肝癌细胞干性维持潜能，发挥化疗增敏作用。本研究虽然为未来高氧诱导肝癌化疗增敏提供了实验依据，但仍远未解决如何在高氧治疗时实现对肝癌患者的趋利避害问题，未来基于氧含量在肝癌患者中的临床应用仍有很远的路要走。

基金资助:国家自然科学基金项目(编号:82272880);天津市卫生健康委员会科技项目(编号:TJWJ2022XK041,TJWJ2022XK042,TJWJ2022MS051,TJWJ2022QN101);天津市医学重点学科(专科)建设项目资助(编号:TJYXZDXK-079D);

文章来源:闫玉兰,张春艳,邵志江等.氧含量通过调节蛋白质类泛素化修饰影响肝癌化疗药物敏感性的研究[J].现代肿瘤医学,2023,31(23):4295-4300.