肝癌是全世界范围内癌症相关死亡的第二大原因，其中肝癌发病率最高的地区位于亚洲和非洲[1]。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常见的肝癌类型，占肝癌发病率的70%～90%[2]。近年来，肝切除、化疗、免疫治疗、靶向治疗等多种治疗方法在临床得到广泛应用并且取得了较好的治疗效果，但患者的5年生存率仍然不理想[3]。细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)是丝裂原活化蛋白激酶信号通路的三条途径之一，ERK能够参与细胞的增殖、分化、凋亡等多种生理病理过程[4]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是血管生成的诱导剂。研究指出[5],部分肿瘤组织缺氧时产生VEGF,其能够结合内皮细胞表面的酪氨酸激酶受体从而激活血管形成通路，激活ERK,使得内皮细胞增殖，利于血管生成。基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)能够参与细胞外基质降解、血管生成等，是与肿瘤侵袭和迁移相关的重要蛋白酶[6]。本研究以人肝癌HepG2细胞为研究对象，通过特异性ERK-VEGF/MMP-9信号通路抑制剂GDC-0994及转染ERK1质粒进行干预，探究ERK-VEGF/MMP-9信号通路对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等不良生物学行为的调控作用，为肝癌的治疗提供参考。

1、材料与方法

1.1 材料

人肝癌HepG2细胞(中国科学院上海细胞库);ERK1/2抗体、VEGF、MMP-9(美国Cell Signaling公司);特异性ERK-VEGF/MMP-9信号通路抑制剂GDC-0994(Genentech公司);山羊抗兔抗体、山羊抗鼠抗体(Invitrogen 公司);二甲苯(上海凛恩科技发展有限公司);胎牛血清(浙江天杭生物股份有限公司);苏木精(北京兰杰柯科技有限公司);青霉素(北京索莱宝科技有限公司);链霉素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);0.25%胰蛋白酶(武汉博士德生物公司);低糖DMEM培养液(美国Gibco公司);ERK1质粒(深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司构建)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

人肝癌HepG2细胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中37 ℃ 5%CO2培养，2～3 d更换培养基，达对数生长期进行下一步实验。

1.2.2 细胞分组

54个培养皿分为对照组，阻断组及转染组，各18,其中对照组肝癌HepG2细胞未进行任何干预；阻断组肝癌HepG2细胞使用特异性ERK-VEGF/MMP-9信号通路抑制剂GDC-0994;转染组细胞转染ERK1质粒。

1.2.3 MTT检测细胞增殖率

细胞生长至80%时将浓度调整为5×104个/mL,接种于96孔板，200 μL/孔，添加GDC-0994使细胞浓度固定为100 nmoL/L,转染组细胞转染ERK1质粒，对照组未进行任何干预，各设三复孔，培养72 h后每孔中加入20 μL的MTT并孵育4 h, 后加入150 μL二甲基亚砜，用酶标仪于波长490 nm处检测吸光度(OD)值，最后得出细胞增殖率。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡

人肝癌HepG2细胞浓度调整为1×105个细胞/孔，接种于96孔板，添加GDC-0994使细胞浓度固定为100 nmoL/L,转染组细胞转染ERK1质粒，对照组未进行任何干预，培养24 h, 后置于500 μL 70%冷乙醇中固定2 h。37 ℃下在人肝癌HepG2细胞中加入100 μL RNA酶温育30 min, 加入400 μL碘化丙，置于4 ℃中避光30 min, 经流式细胞仪进行分析，观察细胞周期及凋亡情况。

1.2.5 细胞迁移、侵袭实验分析ERK-VEGF/MMP-9信号通路对肝癌HepG2细胞迁移、侵袭行为的作用

Transwell板上室预涂Matrigel, 分组及药物干预同上，干预后细胞置于上室，10%FBS培养基置于下室，室温24 h后，采用4%多聚甲醛固定，10 min后0.1%结晶紫染色20 min, 随机选五个视野，镜下观察并计数。迁移实验除不涂Matrigel, 其余操作过程同上。

1.2.6 Western blot法检测ERK、VEGF以及MMP-9蛋白表达

人肝癌HepG2细胞加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法定量蛋白。取20 μg蛋白，10%SDS-PAGE分离，蛋白转移至PVDF膜，室温下于5%脱脂奶粉封闭1 h, 洗涤，加一抗小鼠抗人ERK1/2单克隆抗体(1∶1 000)、兔抗鼠MMP-9多克隆抗体(1∶1 000)以及兔抗人VEGF单克隆抗体(1∶1 000),4 ℃孵育过夜，加入二抗辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶1 000)或山羊抗小鼠IgG(1∶1 000),室温孵育2 h, 洗涤，ECL显影1 min, Quantity One 4.6.6和Image J 1.41软件进行定量分析。

1.3 统计学分析

研究数据经SPSS 21.0进行统计学分析，正态分布且方差齐的计量资料采用

表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异存在统计学意义。

2、结果

2.1 肝癌HepG2细胞增殖率

与对照组相比，阻断组细胞增殖率下降(P<0.05),转染组细胞增殖率上升(P<0.05),见表1、图1。

表1 肝癌HepG2细胞增殖率

图1 肝癌HepG2细胞增殖率对比(***P<0.05)   

2.2 肝癌HepG2细胞周期

与对照组相比，阻断组G0/G1期细胞占比差异无统计学意义(P>0.05),S期及G2/M期细胞占比增加(P<0.05);转染组G0/G1期细胞占比差异无统计学意义(P>0.05),S期及G2/M期细胞占比减少(P<0.05),见表2、图2。

表2 肝癌HepG2细胞周期

图2 肝癌HepG2细胞周期变化   

2.3 肝癌HepG2细胞凋亡率

与对照组相比，阻断组细胞凋亡率增加(P<0.05);转染组细胞凋亡率下降(P<0.05),见表3、图3。

表3 肝癌HepG2细胞凋亡率

2.4 肝癌HepG2细胞迁移数

与对照组相比，阻断组肝癌细胞迁移数降低(P<0.05);转染组肝癌细胞迁移数增加(P<0.05),见表4、图4。

2.5 肝癌HepG2细胞侵袭数

与对照组相比，阻断组肝癌细胞侵袭数降低(P<0.05);转染组肝癌细胞侵袭数增加(P<0.05),见表5、图5。

2.6 ERK、VEGF及MMP-9蛋白表达

与对照组相比，阻断组ERK、VEGF及MMP-9蛋白表达均下降(P<0.05);转染组ERK、VEGF及MMP-9蛋白表达均上升(P<0.05),见表6、图6。

表4 肝癌HepG2细胞迁移数

表5 肝癌HepG2细胞侵袭数

图3 肝癌HepG2细胞凋亡率变化   

图4 肝癌HepG2细胞迁移情况(结晶紫染色)   

图5 肝癌HepG2细胞侵袭情况(结晶紫染色)   

表6 ERK、VEGF及MMP-9蛋白表达

3、讨论

肝癌是发生在肝脏部位的恶性肿瘤，其发病率高、致死率高，严重威胁患者的生命安全[7]。肝癌的发病机制复杂，常见致病原因包括病毒性肝炎、肝硬化、黄曲霉素等，早期肝癌患者症状并不明显，且症状难以察觉，待发展至中晚期，患者出现肝区疼痛、乏力消瘦、肝脏进行性增大等显著体征[8],早发现、早诊断、早治疗是提高肝癌治疗效果的关键，有利于改善患者预后，提高生存质量，但中晚期肝癌治疗方法复杂，且疗效因人而异，再者，肝癌患者易发生局部淋巴结转移、腹腔种植转移、远处转移，因此其总体生存率较低，远期预后较差[9]。相关研究指出，肝癌的发生与过量表达转移基因异常产物如MMPs和VEGF密切相关[10]。

图6 ERK、VEGF及MMP-9蛋白表达   

ERK是广泛表达的蛋白激酶细胞内信号分子，其参与调节分化细胞中的减数分裂，有丝分裂和有丝分裂后等功能，许多不同的刺激，包括生长因子、细胞因子、病毒感染、异源三聚体G蛋白偶联受体的配体、转化剂和致癌物均可激活ERK途径[11]。在MAPK/ERK途径中，Ras激活c-Raf, 然后激活丝裂原活化蛋白激酶激酶，再激活MAPK1/2[12],Ras通常通过受体酪氨酸激酶和GRB2/SOS被生长激素激活，但也可能接收其他信号，已知ERK激活许多转录因子，例如ELK1和一些下游蛋白激酶[13]。ERK途径的破坏在癌症中是常见的，尤其是Ras, c-Raf和诸如HER2的受体[14]。ERK作为MAPK信号转导家族的关键分子，包含多个亚型，其在癌症迁移和侵袭中发挥关重要作用，持续激活ERK及升高其基础活性都可加速细胞的增殖，有研究显示在超过一半的人类癌症类型中存在ERK/MAPK通路的突变或异常激活[15]。本研究以人肝癌HepG2细胞为研究对象，通过特异性ERK-VEGF/MMP-9信号通路抑制剂GDC-0994及转染ERK1质粒进行干预，探究ERK-VEGF/MMP-9信号通路对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等不良生物学行为的调控作用，为肝癌的治疗提供参考。

本研究通过MTT法检测肝癌HepG2细胞增殖情况，结果表明，阻断组肝癌HepG2细胞增殖率较对照组及转染组下降，提示阻断ERK-VEGF/MMP-9信号通路可抑制肝癌细胞增殖，而转染ERK1质粒则促进肝癌细胞增殖。流式细胞仪检测肝癌HepG2细胞周期及凋亡发现，阻断组肝癌HepG2细胞凋亡率较高，并且在S期及G2/M期，阻断组肝癌HepG2细胞凋亡比率显著高于对照组及转染组。经细胞迁移、侵袭实验发现，阻断组肝癌HepG2细胞迁移、侵袭数显著下降，而转染ERK1质粒后，肝癌HepG2细胞迁移、侵袭数则显著上升，提示阻断ERK-VEGF/MMP-9信号通路可抑制肝癌细胞迁移及侵袭。Western blot实验检测ERK、VEGF以及MMP-9蛋白表达发现，阻断组ERK、VEGF及MMP-9蛋白表达均下降，而转染组ERK、VEGF及MMP-9蛋白表达均上升，这提示使用特异性ERK-VEGF/MMP-9信号通路抑制剂GDC-0994可以抑制肝癌HepG2细胞的增殖、迁移及侵袭，还能够诱导肝癌HepG2细胞凋亡，这表明ERK-VEGF/MMP-9信号通路在肝癌细胞的生物学行为中发挥着巨大作用。ERK1/2是调节蛋白、促进新陈代谢的关键酶，还能够介导细胞反应，调节细胞生物学行为，它通过Ras蛋白激活以磷酸化和去磷酸化的方式对外来刺激信号作出应答[16,17,18]。MMPs化学本质为一种蛋白酶，可靶向降解细胞外基质，而肿瘤转移的基础条件之一是细胞外基质降解，MMPs包含的多种蛋白成员能够将不同的细胞外基质成分降解[19]。VEGF是促血管生成因子，可以增加血管通透性及血管内皮细胞增殖，还可以自分泌的形式促进肿瘤细胞生长。研究指出[20],ERK信号通路不仅参与了肝癌的发生发展，而且参与了肝癌细胞凋亡、增殖、细胞因子的表达及MMPs和VEGF的产生。本研究提示ERK信号通路激活后调控相关基因表达从而引起MMP-9表达失衡，使得肝癌细胞迁移及侵袭，而特异性ERK-VEGF/MMP-9信号通路抑制剂GDC-0994则对肝癌的治疗具有显著临床意义。临床可将ERK-VEGF/MMP-9信号通路作为肝癌治疗靶点，通过信号级联反应进行研究，研制相关药物。

综上所述，阻断ERK-VEGF/MMP-9信号通路可降低肝癌HepG2细胞增殖率，诱导肝癌HepG2细胞凋亡，抑制肝癌HepG2细胞迁移及侵袭，为肝癌的治疗提供新思路。

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基金资助:江西省卫生健康委科技计划(编号:202140220);

文章来源:陈君,尚红娟,疏云.ERK-VEGF/MMP-9信号通路对肝癌HepG2细胞不良生物学行为的调控作用[J].现代肿瘤医学,2023,31(24):4491-4496.