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Wnt/β-catenin通路促进结直肠癌细胞对5-FU的药物敏感性

2023-11-14 103 上传者：管理员

摘要：目的:探讨早期生长反应1(EGR1)调控Wnt/β-catenin通路对结直肠癌细胞的5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药的影响及机制。方法:首先构建EGR1过表达载体转染至结直肠癌LoVo细胞，并结合Wnt/β-catenin通路抑制剂，将细胞分为Control组、EGR1 NC组、ov-EGR1组、inhibitor组和ov-EGR1+inhibitor组。CCK8检测细胞增殖活性，流式细胞术检测细胞凋亡，qRT-PCR检测EGR1的mRNA表达，Western blot检测Caspase3、EGR1和β-catenin的蛋白表达。分别用0、1、5、10、20、40μmol/L的5-FU处理各组细胞，通过CCK8检测细胞活性评价药物敏感性变化。结果:与Control组相比，EGR1过表达和Wnt/β-catenin通路抑制剂均能抑制细胞增殖活力(P<0.05),提高细胞凋亡率(P<0.05),上调EGR1 mRNA和蛋白表达(P<0.05),Caspase 3蛋白表达(P<0.05),下调β-catenin蛋白表达(P<0.05),增强细胞对5-FU的药物敏感性(P<0.05)。与inhibitor组相比，ov-EGR1+inhibitor组细胞增殖活力下降(P<0.05),细胞凋亡率上升(P<0.05),EGR1 mRNA表达上调(P<0.05),EGR1和Caspase 3蛋白表达上调(P<0.05),β-catenin蛋白表达下调(P<0.05),细胞的药物敏感性增强(P<0.05)。结论:上调EGR1表达能抑制Wnt/β-catenin通路的激活，降低人结直肠癌细胞对5-FU的耐药性，进而促进癌细胞凋亡。

关键词：
Wnt/β-catenin通路
复发率
早期生长反应1
结直肠癌
耐药
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结直肠癌是一种常见的高发恶性肿瘤，在消化系统极为常见。目前，结直肠癌的治疗方案仍以手术、放疗、化疗为主。但I期和II期疾病的患者在手术后5年内有30%的复发率，而III期患者复发率高达50%～60%[1]。因此，以5-氟尿嘧啶(5-FU)为基础的化疗联合手术治疗已成为III期和高风险II期结直肠癌患者的标准治疗方案，可显著降低复发风险[2]。然而，在临床长期使用5-FU时，结直肠癌患者普遍出现耐药，使治疗受限甚至失败。因此，了解5-FU耐药的机制对于改善结直肠癌的化疗极为重要。

EGR1是组织癌变的关键转录因子，既能通过诱导细胞增殖、血管生成和侵袭来加速肿瘤的生长和进展，还能表现出抑癌功能，诱导肿瘤细胞凋亡[3,4]。SHAO等人[5]发现EGR1的低表达与结直肠癌患者的不良预后有关，但EGR1与结直肠癌5-FU耐药之间的作用关系尚无相关报道。KE等人[6]发现EGR1下调参与Wnt/β-catenin通路蛋白的转导，促进苯并芘诱导的肺肿瘤发生，而抑制Wnt通路能通过调节细胞质中β-catenin的稳定性抑制结直肠癌的生长、转移和对5-FU敏感和耐药[7]。因此，推测EGR1可介导Wnt/β-catenin通路影响结直肠癌细胞的5-FU耐药，并构建EGR1过表达载体，结合Wnt/β-catenin通路抑制剂进行验证，以研究5-FU耐药进展的潜在分子机制。

1、材料与方法

1.1 细胞与试剂

LoVo人结直肠癌细胞购自中国科学院上海细胞库。F12 K、胎牛血清、Opti-MEM购自美国Gibco公司，胰蛋白酶、CCK8、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京solarbio公司，Lipofectamine® RNAiMAX购自Invitrogen公司，KYA1797K购自MCE,Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自美国BD公司，Trizol购自ambion公司，SYBR FAST qPCR Master Mix购自KAPA Biosystems公司，PrimeScript II RTase购自TAKARA公司，化学发光试剂购自millipore公司，抗体Caspase 3、EGR1、β-catenin、GAPDH、羊抗兔IgG购自bioswamp公司，5-氟脲嘧啶(5-FU)购自sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人结直肠癌细胞解冻后，离心重悬，加入到含10%胎牛血清的F12 K培养基中，于培养箱内培养，条件为37 ℃,5%的CO2。待细胞汇合度达到80%时，胰酶消化并进行1∶2传代培养。

1.2.2 EGR1过表达载体的构建和细胞转染

根据EGR1的序列(GeneID:1958),构建EGR1过表达载体和NC载体，稀释于Opti-MEM中。按照说明书用Opti-MEM稀释Lipofectamine® RNAiMAX,混匀载体和Lipofectamine® RNAiMAX室温孵育20 min。调整6 孔板中每孔浓度为5×105 个细胞，培养24 h, 融合度达到90%时加入复合物，37 ℃,5%CO2条件下转染4 h, 更换新鲜培养基培养48 h, 然后检测转入基因表达情况。

1.2.3 细胞干预及分组

将细胞分Control组、EGR1 NC组、ov-EGR1组、inhibitor组和ov-EGR1+inhibitor组。Control组细胞正常培养，EGR1 NC组转染NC载体，ov-EGR1组转染EGR1过表达载体，inhibitor组细胞用25 μmol/L的Wnt/β-catenin通路抑制剂KYA1797K处理，ov-EGR1+inhibitor组细胞用25 μmol/L的Wnt/β-catenin通路抑制剂预处理1 h, 再转染EGR1过表达载体。

1.2.4 CCK8检测细胞增殖活性

调整96 孔板中人结直肠癌细胞悬液的浓度为3×103 个细胞/孔，37 ℃、5%CO2培养箱中培养。细胞贴壁后按照 1.2.3步骤所述处理，继续培养48 h, 加入10 μL CCK8溶液，4 h后测定各孔450 nm处吸光值。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡

调整各组细胞浓度为1×106个，离心后向沉淀物中加入预冷PBS混匀，再次离心重悬，加入Annexin V-FITC和PI,4 ℃避光孵育30 min, 进行流式检测。

1.2.6 qRT-PCR检测EGR1 mRNA表达

Trizol试剂匀浆，离心后氯仿提取上清液，异丙醇沉淀，乙醇漂洗，提取细胞总mRNA。根据PrimeScript II RTase试剂盒与SYBR FAST qPCR Master Mix试剂盒进行RNA反转录和cDNA PCR扩增。实验以GADPH mRNA表达水平为内参，根据所测Ct值，用2-△△Ct计算EGR1 mRNA表达。引物序列为：EGR1-F:CAGTGCCATCCAACGACA,EGR1-R:TAGACAGAGGGGTTAGCGA;GAPDH-F:GGGAAACTGTGGCGTGAT,GAPDH-R:GAGTGGGTGTCGCTGTTGA。

1.2.7 Western blot检测Caspase 3、EGR1、β-catenin蛋白表达

从组织中提取蛋白质，使用BCA检测试剂盒测定蛋白质浓度。每个样品取20 μg的蛋白质加入在含有上样缓冲液的12%的SDS-PAGE凝胶上电泳分离，将蛋白质转移到PVDF膜上。膜在室温下与5%脱脂奶粉孵育1 h, 在4 ℃下与一抗Caspase 3、EGR1、β-catenin孵育过夜。用PBST清洗膜，二抗孵育1 h, 加入ECL发光液显影。

1.2.8 CCK8检测细胞增殖活性评价药物敏感性

按1.2.3所述方法对细胞进行分组，分别用0、1、5、10、20和40 μmol/L 5-FU处理48 h, 通过CCK8检测细胞增殖活性评价各组人结直肠癌细胞对药物5-FU的敏感性变化。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析。数据用均值±标准差

表示，符合正态分布，采用单因素方差分析对数据进行比较。P<0.05被认为差异显著。

2、结果

2.1 qRT-PCR检测转染效率

与正常培养的细胞(1.00±0.10)相比，转染EGR1 NC载体的细胞EGR1 mRNA表达(0.83±0.09)无显著差异，转染EGR1过表达载体的细胞EGR1 mRNA表达(2.12±0.17)显著上升(P<0.05),证明EGR1过表达载体成功转染。

2.2 CCK8检测细胞增殖活力

与Control组相比，ov-EGR1组和inhibitor组细胞增殖活力均显著下降(P<0.05)。与inhibitor组相比，ov-EGR1+inhibitor组细胞增殖活力显著下降(P<0.05),见图1。

图1 EGR1和Wnt/β-catenin通路抑制剂对人结直肠癌细胞增殖活力的影响

2.3 流式细胞术检测细胞凋亡

与Control组相比，ov-EGR1组和inhibitor组细胞凋亡率均显著上升(P<0.05)。与inhibitor组相比，ov-EGR1+inhibitor组细胞凋亡率显著上升(P<0.05),见图2。

图2 EGR1和Wnt/β-catenin通路抑制剂对人结直肠癌细胞凋亡率的影响

2.4 qRT-PCR检测EGR1 mRNA表达

与Control组相比，ov-EGR1组和inhibitor组细胞EGR1 mRNA 表达均显著上升(P<0.05)。与inhibitor组相比，ov-EGR1+inhibitor组EGR1 mRNA表达显著上升 (P<0.05),见图3。

图3 EGR1和Wnt/β-catenin通路抑制剂对人结直肠癌细胞EGR1 mRNA表达的影响

2.5 Western blot检测EGR1、Caspase 3和β-catenin的蛋白表达

与Control组相比，ov-EGR1组和inhibitor组细胞EGR1和Caspase 3蛋白表达均显著上升(P<0.05),β-catenin蛋白表达均显著下降(P<0.05)。与inhibitor组相比，ov-EGR1+inhibitor 组EGR1和Caspase 3蛋白表达均显著上升 (P<0.05),β-catenin蛋白表达显著下降(P<0.05),见图4。

2.6 CCK8检测药物5-FU敏感性

随5-FU作用浓度(0、1、5、10、20、40 μmol/L)的增大，人结直肠癌细胞增殖活力呈浓度依赖性下降。其中ov-EGR1与抑制剂连用时细胞药物敏感性最强。与Control组相比，ov-EGR1组和inhibitor组IC50显著下降(P<0.05),与inhibitor组相比，ov-EGR1+inhibitor组IC50显著下降(P<0.05),见图5。

3、讨论

大多数结直肠癌患者在确诊时已处于晚期，晚期患者的5年生存率仅为10%～15%[8]。结直肠癌的发展依赖于癌基因和抑癌基因基因突变和表观遗传改变，这些改变控制着肿瘤的发生和发展[9]。因此，在癌变过程中调节基因表达和某些信号通路的转录因子是潜在的治疗靶点。

图4 EGR1和Wnt/β-catenin通路抑制剂对人结直肠癌细胞EGR1、Caspase 3和β-catenin的蛋白表达的影响

图5 EGR1和Wnt/β-catenin通路抑制剂对人结直肠癌细胞5-FU敏感性的影响

Compare with control group, *P<0.05.Compare with inhibitor group, △P<0.05.

EGR1以单体的形式与DNA结合，激活转录，调节细胞的生长和分化响应信号。肺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤和卵巢癌等癌症中，EGR1均表现出肿瘤抑制功能，参与癌细胞增殖、凋亡和迁移，甚至影响肿瘤微环境[10]。ZHANG[11]研究发现，与EGR1高表达的患者相比，EGR1低表达的肾透明细胞癌患者更容易出现转移和预后不良，细胞生化分析进一步发现EGR1能抑制肾透明细胞癌的增殖、侵袭和转移。临床数据表明，结直肠癌患者病变肿瘤组织中EGR1的蛋白表达显著低于相邻正常组织[12]。本研究中，人结直肠癌LoVo细胞中EGR1低表达，转染EGR1过表达载体后，人结直肠癌细胞增殖活力下降，凋亡蛋白表达增加，凋亡率上升，说明上调人结直肠癌细胞中EGR1的表达可以抑制肿瘤的生长，与已有研究一致[13]。

研究表明，Wnt/β-catenin通路信号的激活对于结直肠癌的进展是不可或缺的，其通路的状态主要与β-catenin的稳定性有关[14]。EGR1已被证明可以诱导糖原合成酶激酶β活性的增加，进而磷酸化β-catenin并诱导其蛋白酶体降解，减弱β-catenin表达和β-catenin依赖性T细胞因子/淋巴细胞增强因子的转录活性[15]。同时，有文献证明在乳腺癌细胞中，WNT11是EGR1蛋白的直接靶点[16]。MA等[17]使用siRNA沉默人慢性粒细胞白血病细胞中EGR1表达后，Wnt/β-catenin信号通路的表达显著增加。本研究中，人结直肠癌细胞中转染EGR1过表达载体后，β-catenin表达下降，与Wnt/β-catenin通路信号抑制剂作用一致。这说明在结直肠癌中，EGR1通过调控Wnt/β-catenin通路抑制肿瘤细胞病理发展。

5-FU是一种人工合成的尿嘧啶类似物，主要通过抑制胸腺酸合成酶，干扰DNA复制或掺入DNA,引起核苷酸序列的破坏而起作用，从而导致细胞死亡[18]。但目前，5-FU的化学耐药性仍是结直肠癌治疗的主要障碍。而耐药最直接的原因是抗肿瘤药物代谢、转运或靶点异常。已有报道证实了EGR1与其他癌细胞化疗药物耐药之间的作用，通过激活EGR1信号通路诱导细胞凋亡死亡，能逆转泌乳素瘤细胞的溴隐亭耐药[19]。且Wnt/β-catenin通路也与癌细胞对5-FU的耐药性密切相关，靶向Wnt/β-catenin信号通路能增加结直肠癌对5-FU的敏感性[20]。本研究中，上调EGR1表达和抑制Wnt/β-catenin信号后，人结直肠癌细胞的药物敏感性均增强，且二者联用后，人结直肠癌细胞对5-FU的敏感性增加更加显著。这说明EGR1可能通过Wnt/β-catenin通路降低人结直肠癌细胞对5-FU的耐药性。

综上，上调EGR1表达能降低人结直肠癌细胞对5-FU的耐药性，促进癌细胞凋亡，其机制可能与抑制Wnt/β-catenin通路的激活有关。

文章来源:杨厚涞,夏天.EGR1通过调控Wnt/β-catenin通路促进结直肠癌细胞对5-FU的药物敏感性[J].现代肿瘤医学,2023,31(24):4531-4535.