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PI3K/Akt信号通路探讨槲皮素对肝癌细胞增殖凋亡的影响

2024-04-27 44 上传者：管理员

摘要：目的研究槲皮素的抗肝癌作用，并进一步探究其与磷酸肌醇3-激酶/苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路的关系。方法肝癌细胞BEL-7402分为对照组、槲皮素低、中、高剂量组，分别用不同浓度的槲皮素处理(0、80、160、320μmol/L)。采用噻唑蓝(MTT)实验比较细胞24、48、72 h的增殖抑制率，采用平板克隆实验比较各组细胞克隆形成率，流式细胞术实验比较各组细胞的凋亡率及细胞周期分布情况，Western印迹实验比较细胞周期蛋白(Cyclin)D1、裂解的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved Caspase)-3、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、磷酸酶及张力蛋白同系物(PTEN)、磷酸化(p)-PI3K、p-Akt蛋白含量情况；采用分子对接学分析槲皮素与Akt、PI3K的结合。结果与对照组比较，经不同剂量槲皮素处理组肝癌细胞增殖抑制率、细胞凋亡率明显增加，细胞克隆形成率明显降低，S期细胞数明显减少，G0/G1期细胞数明显增加，细胞内Cleaved Caspase-3、Bax、PTEN蛋白含量明显增加，CyclinD1、Bcl-2、p-PI3K及p-Akt蛋白含量明显减少(P<0.05),槲皮素与Akt、PI3K分子结合能分别为-5.47、-6.74。结论槲皮素具有明显的抗肝癌作用，主要通过诱导细胞凋亡、阻断细胞周期进而抑制细胞增殖实现的，可能与调控PI3K/Akt通路的表达有关。

关键词：
手术治疗
槲皮素
磷酸肌醇3-激酶
肝癌
苏氨酸蛋白激酶
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肝癌属于消化道类恶性肿瘤，根据其发病类型分为原发性及继发性，我国是肝癌发病大国，我国肝癌发病率占世界肝癌发病率的半数[1],是临床高发性恶性肿瘤。并且由于早期肝癌无特异性临床症状，当癌症发展至中晚期才表现出明显症状，大多数肝癌患者确诊时病程已十分严重，基本无法采取手术治疗且癌细胞转移能力较强，进一步导致该病的致死率极高[2,3],是治愈难度较高的一种癌症。中药提取物作为一类毒副作用较小的天然药物，随着现代中药的发展，它在抑制肿瘤生长方面的研究也逐渐受到重视[4]。槲皮素抗癌活性一直受到广泛关注，通过阻断肿瘤细胞增殖通路调节相关靶点抑制癌细胞生长，在促进细胞凋亡方面有明显功效[5,6]。研究发现，磷酸肌醇3-激酶/苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)通路与肿瘤细胞增殖存在相关性[7],其异常表达与肝癌细胞的恶性增殖、迁移等过程有关[8,9]。本研究探讨槲皮素对肝癌的抑制作用及其对PI3K/Akt通路的调控作用。

1、资料与方法

1.1 细胞培养

实验细胞为中国科学院提供的人肝癌BEL-7402细胞株。

1.2 试剂与仪器

槲皮素(货号20201117,含量98%,厂家为陕西斯诺特生物技术有限公司);噻唑蓝(MTT)试剂购自山东西亚化学科技有限公司；瑞氏染色液(货号M061,厂家为上海歌凡生物科技有限公司);p-PI3K一抗、p-Akt一抗、磷酸酶及张力蛋白同系物(PTEN)一抗、裂解的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved Caspase)-3一抗、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2一抗、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、山羊抗兔多克隆lgG二抗(货号ab32089、ab18785、ab267787、ab32042、ab32503、ab32124、ab150077)均由英国Abcam公司提供；膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒(货号17104A,厂家为北京君诺德生物科技有限公司);电化学发光(ECL)试剂盒(货号BHS63609,厂家为上海博湖生物科技有限公司);XDS-900C型光学显微镜(厂家为上海蔡康光学仪器厂);CytoFLEX型流式细胞仪(厂家为美国Beckman公司)。

1.3 MTT比色实验检测各组细胞增殖能力

将细胞分为对照组(槲皮素剂量0 μmol/L)及槲皮素低、中、高剂量组(槲皮素剂量分别为80、160、320 μmol/L[10]),接种于96孔板，加入相应剂量的槲皮素处理24、48、72 h。向每孔滴加20 μl 5 mg/ml的MTT溶液，遮光培养4 h后吸取上清液并倒入200 μl二甲基亚砜(DMSO)溶液，进行充分振荡溶解，记录490 nm处细胞吸光值A,并得出增殖抑制率(%)=(1-给药组A值/对照组A值)×100%。

1.4 平板克隆实验检测各组细胞克隆

将对数期细胞分别接种于6孔板中培养(每孔约200个),细胞贴壁生长后加入相应浓度的槲皮素处理24 h。将处理后的细胞置于培养箱内常规培养至出现明显克隆集落，使用甲醛固定并加入瑞氏染色液染色。以大于50个细胞数为标准，克隆形成率(%)=克隆数/每孔细胞数×100%。

1.5 流式细胞术实验比较各组细胞凋亡能力及细胞周期分布

将对数期细胞分别接种于6孔板中培养(每孔约2×105个),细胞贴壁生长后加入相应浓度的槲皮素处理24 h。操作步骤参照检测试剂盒说明，通过流式细胞仪对细胞凋亡率和细胞周期分布情况进行比较。

1.6 Western印迹实验检测各组细胞相关蛋白含量

将对数期细胞分别接种于6孔板中，然后加入相应浓度的槲皮素继续培养24 h。提取总蛋白离心10 min得上部液体，检测蛋白浓度，各组取该样品约30 μg进行电泳，蛋白分离后进行转移，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h, 放入经稀释的一抗(1∶1 000),在4 ℃的环境下培养至第2天，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗净后放入经稀释的二抗(1∶5 000),室温半小时再次用PBS洗净，显色显影后进行计算。

1.7 统计学方法

采用SPSS20.0软件进行方差分析、t检验。

1.8 槲皮素与Akt、PI3K的分子对接

Akt的X-ray晶体结构从Uniport中下载，序列号5WBY,分辨率为3.10Å;PI3K的X-ray晶体结构从Uniport中下载，序列号1PBW,分辨率为3.10Å。运用YASARA分子模拟软件进行结构优化；运用软件 AutoDock4.0 进行刚性分子对接，槲皮素分子构象的搜索使用 Lamarchian 遗传算法。

2、结果

2.1 各组细胞增殖能力比较

与对照组比较，不同剂量槲皮素组肝癌细胞增殖抑制率均明显增加(P<0.05),其中槲皮素高剂量组细胞增殖抑制率增长最明显，且各组细胞增殖抑制率均随作用时间增加而增大。见表1。

表1 各组细胞增殖抑制率比较

2.2 各组细胞克隆能力比较

与对照组[(96.60±5.53)%]比较，槲皮素低、中、高剂量组肝癌细胞克隆形成率明显降低[(57.00±6.07)%、(36.68±4.28)%、(24.20±2.42)%;F=113.521,P=0.000],其中槲皮素高剂量组细胞克隆形成率降低最明显。见图1。

2.3 各组细胞凋亡能力比较

与对照组比较，槲皮素低、中、高剂量组肝癌细胞凋亡率明显增加(P<0.05),其中槲皮素高剂量组细胞凋亡率增加最明显。见图2、表2。

2.4 各组细胞周期分布比较

与对照组比较，槲皮素低、中、高剂量组肝癌细胞S期细胞数明显减少，G0/G1期细胞数明显增加(P<0.05),其中槲皮素高剂量组细胞比例变化最明显，而4组细胞中G2/M期细胞比例无明显变化(P>0.05)。见表2。

2.5 各组细胞凋亡蛋白含量比较

与对照组比较，槲皮素低、中、高剂量组CyclinD1、Bcl-2蛋白表达均明显降低，Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达均明显增加(P<0.05),其中槲皮素高剂量组细胞各蛋白含量变化最明显。见表2、图3。

图1 各组细胞克隆能力(瑞氏染色液染色)

图2 各组细胞凋亡

表2 各组细胞凋亡率、周期分布、细胞凋亡蛋白含量比较

图3 各组细胞凋亡蛋白表达

2.6 各组细胞PI3K/Akt通路蛋白含量比较

与对照组比较，槲皮素低、中、高剂量组PTEN蛋白含量均明显增加，p-PI3K、p-Akt蛋白含量均明显降低(P<0.05),其中槲皮素高剂量组细胞各蛋白含量变化最明显。见表3、图4。

表3 各组细胞PI3K/Akt通路蛋白表达比较

图4 各组细胞PI3K/Akt通路蛋白表达

2.7 槲皮素与Akt、PI3K的分子对接

分子对接时Grid Box 分子对接格点包含整个模型，分子对接格点为 94×86×113,格点间距为 0.375 nm, 槲皮素与Akt、PI3K分子结合能分别为-5.47、-6.74,槲皮素与Akt、PI3K二维图及三维图显示槲皮素与二者相互连接形成稳定复合物。见图5。

图5 槲皮素与Akt、PI3K分子对接2D、3D图

3、讨论

近年来随着我国医疗科技手段及国民健康意识的提高，肝癌的发病率已有所减缓，但仍未出现明显下降[11],且目前临床缺少有效的肝癌治疗方法，目前常采用的化疗药物易对人体的免疫功能造成伤害并且易产生耐药性，导致肝癌临床治愈率不高，术后五年复发率及死亡率都偏高[12],寻找能够有效治疗肝癌的方法仍是临床研究热点。我国中医药产业正稳步发展，中医药在肿瘤治疗方面的长处也受到了大众关注。从中医角度对肝癌进行辩证，认为肝癌发病主要受正气受损、气滞血瘀、肝阳上亢导致的阴阳两虚影响[13]。槲皮素具有抗炎抗肿瘤等生理作用，特别是在肿瘤方面的研究取得了显著成效。

细胞凋亡主要受基因的调控，不同的凋亡通路将凋亡信号传递至细胞，激活受体靶蛋白引发细胞凋亡。肿瘤细胞不同于正常细胞的显著特征要是无法控制的恶性增殖及自发性死亡过程被阻断，对于其治疗多以抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡为主要途径[14,15]。孙佳等[10]发现，槲皮素在抵抗肝癌细胞增殖及促进其凋亡的作用明显，提示槲皮素确实在肝癌治疗方面有显著功效。本研究提示，槲皮素具有抑制肝癌细胞增殖、促进凋亡的作用。细胞周期进程是肿瘤发展的重要影响因素，特别是G1-S期是抑制肿瘤细胞异常增殖的关键靶点[16]。本研究说明，槲皮素可能阻断肝癌细胞S期发展进程，使G0/G1期细胞大量积累，提示槲皮素对阻碍肝癌细胞周期进程有显著作用。

PI3K/Akt通路是机体内抑制细胞凋亡的经典的作用通路，同时发挥调控细胞增殖、代谢等功能，并且在调控肿瘤发展方面发挥重要作用[17]。PI3K磷酸化与其下游Akt结合产生p-Akt, 磷酸化的Akt能够调节其下游凋亡靶蛋白CyclinD1、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax表达[18]。其中CyclinD1主要在细胞周期G1期表达，并诱导G1期细胞发展进入下一个周期，具有促进细胞增殖作用[19];Cleaved Caspase-3属于Caspase-3凋亡家族，在细胞凋亡的启动及执行过程中发挥作用；Bcl-2、Bax同属于Bcl-2凋亡家族，二者拮抗影响细胞凋亡进程。PTEN是PI3K/Akt通路下游一种重要的抑癌蛋白，对PI3K/Akt通路起负反馈调节作用，与肿瘤发展进程密切相关[20]。本研究结果提示，槲皮素可能通过与Akt、PI3K结合抑制肝癌细胞内PI3K/Akt通路活化，进而调控其下游细胞凋亡蛋白及Cyclin, 阻断细胞周期的发展进程，同时加速细胞的凋亡进程，并且通过高水平的PTEN进一步阻碍PI3K/Akt通路的活化。

参考文献:

[1]魏矿荣,彭侠彪,梁智恒,等.全球肝癌流行概况[J].中国肿瘤,2015;24(8):621-30.

[2]魏蔚,刘玉华.姜黄素通过活化PI3K/Akt信号通路逆转肝癌耐药细胞株Bel7402 /AD的耐药性[J].中国老年学杂志,2018;38(12):3015-9.

[7]肖洁,牛国敏,尹松梅,等.槲皮素抑制HL-60细胞增殖与诱导凋亡机制探讨[J].中华肿瘤防治杂志,2014;21(21):1685-90.

[9]李懿,赵莉莉,李易,等.表没食子儿茶素没食子酸酯通过PI3K/AKT信号通路抑制人肝癌细胞株HepG2增殖和促进凋亡[J].世界华人消化杂志,2015;(23):3188-94.

[10]孙佳,赵东耕,王明艳,等.槲皮素对SMMC-7721肝癌细胞PI3K/AKT信号通路影响的探讨[J].中国实验方剂学杂志,2012;18(18):223-6.

[11]高春.肝癌分子病理流行病学[J].世界华人消化杂志,2018;26(9):557-63.

[12]曹宏伟,李赛华,胡海龙.原发性肝癌手术治疗的生存率及影响因素研究[J].中国卫生标准管理,2019;10(24):17-20.

[13]刚小青,吴衡慧,周文磊.白桦脂醇通过抑制PI3K/ Akt途径抑制宫颈癌小鼠移植瘤增殖[J].中国免疫学杂志,2019;35(10):1227-31.

[15]高启龙,朱亚楠,石变,等.青龙衣含药血清抑制胃癌SGC-7901细胞生长和诱导凋亡[J].中国实验方剂学杂志,2017;23(13):111-5.

[16]徐楗荧,崔红晶,蔡桂丰,等.花姜酮对人绒毛膜癌JEG-3细胞增殖和细胞周期的影响[J].广东医学,2019;40(13):1837-40.

[17]钟宇,郑学宝,蔡康荣,等.异丁酰紫草素通过PI3K/Akt/m-TOR通路靶向抑制结肠癌细胞增殖的研究[J].中国中药杂志,2018;43(11):2358-64.