骨内植入体在整形外科和牙科应用十分广泛[1,2]。低弹性模量的纯钛或钛合金是目前植入体的首选材料[3]。但钛及钛合金属于生物惰性材料，直接植入常无法获得良好快速的骨结合，制约了其更为广泛的应用。骨结合是骨内植入体植入成功的标志[4]，细胞在种植体表面黏附、增殖是种植体与周围组织作用的关键环节，通过影响细胞黏附、增殖、分化等细胞反应最终影响植入体骨结合性能[5,6,7]。如何通过种植体表面改性促进成骨细胞早期黏附，缩短植入体骨结合时间，增强骨结合强度，仍然是口腔种植体领域研究热点[8,9,10]。研究证实，通过电化学阳极氧化形成的纳米级表面形貌可以促进成骨细胞在植入体表面的早期附着[11]。同时，骨具有微纳米级共存的梯度结构[12]，从仿生角度，具有微纳米级共存的梯度仿生表面结构更利于植入体-周围骨组织营养运输和骨引导生长[13]。目前，钛材如何在三维空间中影响细胞-植入体的相互作用尚未达到共识。本研究制备一种新型微纳米共存的梯度仿生表面结构，即在微米骨小梁样结构上制备TiO2纳米管结构，并研究其对体外大鼠骨髓间充质细胞（bonemarrowmesen-chymalcells,BMMCs）增殖、黏附及成骨向分化潜能的影响。

1、材料和方法

1.1主要材料、试剂及仪器

纯钛材料（中国科学院金属研究所）；SPS-1050放电等离子烧结系统（ThermalTechnologyLLC,SantaRosa,CA，美国）；PGSTAT302N电化学工作站（Metrohm，中国）；4周大雄性SD大鼠（SYXK（川）2018-185）由四川大学动物实验中心提供；10%水合氯醛（四川大学华西妇产儿童医院）；胰蛋白酶、胎牛血清、α-MEM培养基（Gibco，美国）；MTT(Sigma-Aldrich，美国）；碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）检测试剂盒（Beyotime，中国）；DAPI染色液（碧云天生物科技有限公司）；DyLight549标记的山羊抗兔二抗IgG、DyLight488标记的山羊抗鼠二抗IgG、兔抗鼠骨钙素（osteocalcin,OCN）抗体、鼠抗鼠骨桥蛋白（osteopontin,OPN）抗体、AlexFluor647标记的Anti-Vinculin抗体、FITC-phalloidin(Millipore，美国）；引物（Invitrogen，美国）、SYBR定量PCR试剂盒（Takara，日本）；扫描电子显微镜（InspectF,FEI，荷兰）；原子力显微镜（NanoscopeMultiMode&ExpolreSPM,VeccoInstrument，美国）；倒置荧光显微镜（Olympus，日本）；TL101接触角分析仪（TL101,Biolinscientific，瑞典），cDNA试剂盒（Takara，日本）。

1.2材料制备及表征观察

1.2.1材料制备

将纯钛试样预处理，依次用丙酮、去离子水超声清洗10min，高温蒸汽灭菌后备用，命名为纯钛组。一组纯钛试件表面行放电等离子烧结处理，制备微米骨小梁样形貌，命名为微米骨小梁组；一组纯钛试件表面行阳极氧化处理，制备TiO2纳米管形貌，命名为TiO2纳米管组；一组纯钛表面首先通过放电等离子烧结法制备微米骨小梁样形貌，再通过阳极氧化法在微米骨小梁形貌上制备TiO2纳米管结构，形成新型微纳米共存梯度仿生表面结构，命名为微纳米复合钛组。

1.2.2表征观察

(1)表面形貌：扫描电子显微镜观察4组材料表面形貌，通过原子力显微镜进一步观察纯钛组和TiO2纳米管组表面形貌，使用NanoscopeMultiMode图形分析软件对样品表面的表面平均粗糙度均方根、表面积差值（三维表面积比二维表面积的比值增加的百分比）、垂直距离等表面粗糙度指标进行定量分析。

(2)表面能：利用静态水接触角实验检测不同植入材料表面能，每个样本表面随机选取5个点进行测量。

1.3体外实验

1.3.1大鼠骨髓间充质细胞分离和培养

取4周大雄性SD大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后颈椎脱臼处死，浸泡于75%酒精。迅速分离胫骨和腓骨周围的皮肤、肌肉等结缔组织，将股骨和胫骨置于1%双抗溶液中。在无菌条件下，剪去股骨及胫骨的骨垢端，用无菌注射器吸取培养基冲洗骨髓腔获得细胞悬液，1000r/min离心5min后用含10%胎牛血清的α-MEM培养基重悬，记为P0。37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱孵育。48h后首次换液，更换新鲜培养基，隔日换液，待细胞生长至80%～90%融合时按1∶3传代培养。在细胞超净台中，将第2～4代BMMCs以5×104/mL细胞密度接种于4组植入材料表面，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。在不同时间点进行如下检测。

1.3.2细胞黏附情况

细胞接种2h后，PBS清洗2次，2.5%戊二醛固定30min，依次用20%、40%、60%、80%、90%酒精以及无水乙醇梯度脱水，每个梯度脱水10min。将样本轻轻粘在导电胶上，临界点干燥、真空喷镀，行扫描电镜观察。

1.3.3细胞增殖能力（MTT法）

细胞接种于4组材料表面1、3、5、7、9d后，PBS清洗，每孔加入10mg/mL的MTT10μL,37℃培养箱中孵化4h，弃掉上清液，每孔再加入二甲亚砜150μL，室温下孵育15min充分震荡溶解沉淀，使用酶联免疫检测仪检测OD590nm。每组样本在每个时间点选4个平行样进行检测，以纯钛组接种细胞第1天检测的结果为参照，计算各组细胞相对增殖率。

1.3.4碱性磷酸酶检测

钛材样品接种细胞24h后，将培养基更换为成骨诱导液（含体积分数10%的胎牛血清，地塞米松100nmol/L、抗坏血酸50mg/L、β-甘油磷酸钠10mmol/l的α-MEM培养液）。每48h换液1次。培养7、10、14d后，PBS清洗3次，每孔加入0.2%Triton-X-100裂解液400μL，放置4℃过夜。次日细胞裂解液50μL和50μL对硝基苯磷酸盐（p-nitrophenylphosphate,PNPP）孵育30min后每孔加入100μL反应终止液终止反应，使用酶联免疫检测仪在OD405nm。同时按照BCA蛋白定量试剂盒说明书操作测定总蛋白浓度。每组样本在每个时间点选4个平行样进行检测。

1.3.5免疫荧光检测细胞黏着斑蛋白、成骨分化相关蛋白表达

接种24h后，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定30min,0.2%TritonX-100通透15min，避光、4℃条件下AlexFluor647标记的Anti-Vinculin抗体、FITC-phalloidin对各组表面上附着的细胞进行染色并过夜。

接种72h后，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定30min,0.2%TritonX-100通透细胞膜15min，观察OCN、OPN表达。一抗孵育：吸水纸吸掉封闭液，每张爬片上滴加足够量稀释好的一抗（OCN1∶200;OPN1∶200）并放入湿盒，4℃过夜；二抗孵育：取出湿盒，37℃下复温45min,PBS清洗爬片3次，吸水纸吸掉残留的PBS，滴加稀释好的DyLight549标记的二抗IgG(1∶500）、DyLight488标记的二抗IgG(1∶500）。

最后均用DAPI避光染色5min。激光共聚焦显微镜（confocallaserscanningmicroscopy,CLSM）下观察。

1.3.6qRT-PCR检测成骨标志基因表达

细胞接种7d后，用Trizol试剂提取总RNA，使用1步法cDNA试剂盒逆转录成cDNA，再行qRT-PCR检测。引物序列如表1所示。PCR反应条件：95℃预变性30s,95℃变性5s,60℃退火30s，运行40个循环，目的基因表达均依据管家基因GAPDH表达水平进行标准化处理后进行比较，根据2-△△Ct法对成骨标志基因：RUNX2、OCN、OPN和I型胶原（collagentypeI,COLI）进行基因相对表达倍数转化。

1.4统计学分析

采用IBMSPSS19.0软件进行数据分析，结果均以±s来表示，采用单因素方差分析及q检验进行组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。

表1PCR引物序列

2、结果

2.1样品表征

2.1.1材料表面形貌特点分析

扫描电子显微镜下纯钛组表面仅见机械打磨的痕迹（图1a）；微米骨小梁组表面形成微米骨小梁样表面形貌，有些微米管之间互相交通（管径30～100μm），类似骨小梁结构（图1b);TiO2纳米管组表面形成均一排列的TiO2纳米管样结构（图1c、图1d）；微纳米复合钛组表面形成微米骨小梁结构上有均一排列TiO2纳米管的新型梯度仿生表面结构。

图1材料表面形貌扫描电镜观察

原子力显微镜下可见纯钛组表面光滑，没有明显的孔洞或任何规则的形状；TiO2纳米管组纳米孔近似圆形，直径从十几纳米至上百纳米不等，纳米孔深度从十几至几十纳米不等（图2）。AFM粗糙度的定量分析结果见表2,TiO2纳米管组表面比纯钛组粗糙（P<0.001),TiO2纳米管组表面粗糙度、轮廓最大高度偏差、表面积差值分别约为纯钛组的2.9倍、2.2倍、1.9倍。

2.1.2材料表面的表面能检测

4组材料表面的表面能检测结果显示（图3）：静态水接触角分别为35°±2.3°（纯钛组）、18°±1.6°（微米骨小梁组）、14°±1.6°（TiO2纳米管组）和9°±2.1°（微纳米复合钛组）。微纳米复合钛组的静态水接触角最小（P<0.001），说明其表面亲水性最好。

2.2体外材料表面细胞行为

2.2.1细胞黏附情况

4组材料表面接种4h后细胞黏附情况显示，纯钛组细胞多呈梭形，部分可见伪足和触角（图4a）。微米骨小梁组细胞呈扁平多角形，可明显见伪足和触角（图4b）。TiO2纳米管组细胞扁平多角形，紧密附着在材料表面（图4c）。微纳米复合钛组细胞伸展更加充分，细胞与细胞间相互交织连接，大多成片，可见大量伪足和触角（图4d）。

2.2.2细胞增殖能力（MTT)

图2纯钛组和TiO2纳米管组表面AFM扫描图

表2纯钛组和TiO2纳米管组表面参数比较

BMMCs接种4组材料表面增殖活性MTT检测结果如图5所示。接种后1～9d细胞增殖活性呈递增趋势，但1d和3d差异无统计学意义（P=0.278），结果表明，1～4d，微纳米复合钛组和TiO2纳米管组细胞增殖活性高于纯钛组和微米骨小梁组，但差异没有统计学意义。5～9d，微纳米复合钛组和TiO2纳米管组的细胞增殖活性显著高于纯钛组和微米骨小梁组（P<0.001）。

2.2.3ALP活性

图34组材料表面静态接触角

图4骨髓间充质细胞接种于4组钛材表面4h后的扫描电镜图

图5BMMCs接种于4组材料表面后的细胞相对增殖率

BMMCs接种4组材料表面7、10、14dALP活性检测结果如图6。细胞在4组材料表面ALP活性在7～14d呈递增趋势。10d和14d时，TiO2纳米管组和微纳米复合钛组表面细胞ALP活性明显高于纯钛组（P<0.001）。14d时，微纳米复合钛组表面ALP活性最高，说明微纳米复合钛表面促进骨髓间充质细胞成骨向分化。

2.2.4细胞黏附、成骨分化相关蛋白表达

培养24h后，纯钛组黏着斑蛋白染色较微米骨小梁组、TiO2纳米管组和微纳米复合钛组浅，微米管组、TiO2纳米管组和微纳米复合钛组之间无明显差异；TiO2纳米管组和微米骨小梁组中肌动蛋白染色深于纯钛组，微纳米复合钛组肌动蛋白染色最深（图7a）。

培养72h后，纯钛组表达OCN和OPN最弱，微纳米复合钛组表达OCN,OPN比微米骨小梁组和TiO2纳米管组强（图7b）。

2.2.5qRT-PCR检测成骨标志基因表达

TiO2纳米管组和微纳米复合钛组表面细胞所有成骨转录因子的基因表达水平高于纯钛组和微米骨小梁组，其中COLI基因表达水平有显著性差异（P<0.001）。结果表明TiO2纳米管组和微纳米复合钛组促进BMMCs早期成骨转化。纯钛组的OPN和OCN基因表达水平最低，与细胞免疫荧光染色结果一致（图8）。

图6BMMCs接种于4组材料表面后的细胞ALP活性

3、讨论

骨结合是骨内植入体植入成功的标志，良好的骨结合说明人体骨组织与植入体表面形成直接稳定连接，有利于抗压和负重[14]。植入体骨结合效果受其表面性质（如粗糙程度、表面形貌等）的影响，可以通过表面改性增强其骨结合性能，如放电等离子烧结、酸蚀、阳极氧化[15,16,17]。骨具有微纳米级共存的梯度结构，从仿生角度，具有微纳米级共存的梯度仿生表面结构更利于植入体-周围骨组织营养运输和骨引导生长。研究证实微纳米复合钛表面形貌骨结合性能优于微米管和TiO2纳米管表面形貌[18]。本研究制备出一种新型微纳米共存梯度仿生表面结构，首先通过放电等离子烧结法在纯钛表面制备微米骨小梁样结构，再通过阳极氧化法在微米骨小梁样结构上制备TiO2纳米管结构，形成新型微纳米共存梯度仿生表面结构，将BMMCs接种于新型微纳米共存梯度仿生表面结构表面，探究其对大鼠骨髓间充质细胞生物学活性的影响。

MTT细胞增殖结果显示，1～9d，微纳米复合钛组和TiO2纳米管组细胞增殖活性高于纯钛组和微米骨小梁组；5～9d，微纳米复合钛组和TiO2纳米管组的增殖活性显著高于纯钛组和微米骨小梁组；提示联合应用放电等离子烧结和阳极氧化处理的钛表面表面接种的BMMCs增殖活性更好。ALP是成骨分化的早期标志，可水解磷酸离子，形成羟基磷灰石晶体并促进矿化[19]。成骨诱导10d和14d,TiO2纳米管组和微纳米复合钛组表面细胞ALP活性明显高于纯钛组（P<0.001），证实联合应用放电等离子烧结和阳极氧化处理的钛表面可促进BMMCs成骨分化。

图7BMMCs接种于4组材料表面的细胞免疫荧光染色图

图84组成骨转录因子mRNA表达

CLSM结果示微纳米复合钛组和TiO2纳米管组OCN、OPN染色深于纯钛组和微米管组。qRT-PCR结果示TiO2纳米管组和微纳米复合钛组表面细胞的RUNX2、OCN、OPN和COLI基因表达水平强于纯钛组和微米骨小梁组，I型胶原表达水平有显著性差异（P<0.001）。结果表明微纳米复合钛组可促进细胞黏附、增殖以及成骨向分化。

综上所述，联合应用放电等离子体烧结和阳极氧化法在纯钛植入体表面制备的新型微纳米共存的梯度仿生表面结构可促进骨髓间充质细胞的黏附、增殖及成骨向分化。下一步将进行动物体内实验，进一步证实改性钛表面的成骨活性。

参考文献：

[13]许嘉允,邓飞龙,庄秀妹,等.纯钛微纳米复合形貌对成骨细胞生物学行为的影响[J].中华口腔医学研究杂志,2015,9(6):461-469.

[14]罗翠芬,彭国光,冯远华,等.激素对种植体骨结合影响的研究进展[J].口腔疾病防治,2017,25(7):473-476.

王旻,姜楠,祝颂松.新型钛表面微纳米共存梯度仿生结构对骨髓间充质细胞黏附､增殖及成骨分化的影响[J].口腔疾病防治,2021,29(04):226-233.

基金:国家自然科学基金(81901026)