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β-磷酸三钙骨免疫学特性的研究进展

2021-09-17 306 上传者：管理员

摘要：β-磷酸三钙(β-TCP)作为植骨材料具有优良的生物相容性和骨传导性,免疫反应在决定β-TCP体内转归中起着重要的作用,β-TCP作为异物被免疫系统识别,触发免疫细胞的不同行为模式,从而影响着新骨形成。了解β-TCP植入后诱导的免疫环境和成骨之间的影响,有助于诱导最佳的局部免疫环境,为最终骨整合提供成骨和破骨的最佳平衡,本文将对β-TCP在骨免疫学领域的研究作一综述。

关键词：
β－磷酸三钙
植骨材料
骨免疫学
骨再生
骨替代物
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β-磷酸三钙(β-TCP)作为植骨材料，具有优良的生物相容性和骨传导性，在口腔颌面骨缺损修复中有着良好的应用前景。以β-TCP为代表的植骨材料正致力于优化生物力学性能和物理化学性质以诱导干细胞的成骨向分化，然而却存在着体内外研究结果不一致的现象，可能的原因在于体外环境无法模拟体内免疫系统的作用。骨免疫学揭示了免疫系统在调节骨动力学中的重要作用，二者共享大量的细胞因子、受体、信号分子和转录因子[1]。充分了解免疫细胞及其分泌的细胞因子如何作用于成骨，有助于在成骨和破骨之间建立平衡，达到理想的骨再生。本文将对β-TCP在骨免疫学领域的研究(包括免疫细胞、信号通路以及β-TCP复合材料)进行综述。

1、免疫细胞

以β-TCP为代表的骨替代物介导的成骨机制至少涉及3种相互作用的免疫成分：宿主免疫细胞、宿主骨细胞和植骨材料。植入后宿主体首先会对材料产生普遍性免疫反应，来自血液和组织间液的蛋白质，如纤维蛋白原、补体等[2],会在几秒钟内吸附到材料表面，随后凝血级联反应和补体系统被激活，引发急性炎症，中性粒细胞和单核细胞释放蛋白水解酶和活性氧(ROS)来降解植入物，前一阶段释放的细胞因子等使得单核细胞被招募到移植物中，细胞在移植物中分化为巨噬细胞，巨噬细胞随后可融合形成多核巨细胞等[3]。

1.1 巨噬细胞

巨噬细胞是固有免疫细胞，在骨髓中发育为单核细胞，在趋化因子的作用下，穿过毛细血管壁迁移到机体组织中分化为成熟的巨噬细胞[4],在β-TCP介导免疫反应中作为关键的效应细胞起到引发并维持炎症反应的作用。巨噬细胞可能分化成不同的表型，经典活化型(促炎M1型)和替代活化型(抗炎M2型)。在创面愈合初期(1～3d),通过趋化因子将巨噬细胞招募到炎症区，激活M1型来清除病原体，随后极化至M2型，进行修复过程(4～7d)[5]。

早期以经典活化的炎性巨噬细胞(M1型)为主，分泌促炎细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β,传统认为这些细胞因子增强破骨活性，导致骨吸收。M1型巨噬细胞可通过抑制炎症和启动组织修复来决定随后的免疫细胞行为，也可通过之后破坏正常骨组织来增强炎症反应。M2巨噬细胞在修复反应的中后期发挥更显著的作用，导致纤维包膜或新骨的形成，不仅可以分泌成骨细胞因子如BMP-2和VEGF,还分泌炎症和纤维因子如TNF-α、TGF-β1和TGF-β3[6]。至于哪种巨噬细胞表型对成骨更有利，目前仍未达成共识。多数研究认为主要为M2型促进成骨，Chen等[7]发现在β-TCP作用下，巨噬细胞转变为M2型，这可能与CaSR通路的激活有关。也有研究发现M1型巨噬细胞可反应性增强成骨，Guihard等[8]发现M1型巨噬细胞通过OSM诱导成骨，使MSCs向成骨细胞分化。

近期有研究发现巨噬细胞表型很可能在M1和M2之间存在一个连续统一体[6],瞬时巨噬细胞可能具有两种表型的一些特征。M1型巨噬细胞表型的有效和及时的转换可导致M2型巨噬细胞释放增强成骨细胞因子的模式，延长M1极化可导致M2型巨噬细胞释放的促纤维化细胞因子增加[9]。决定骨形成的可能是巨噬细胞转换模式，而不是特定的巨噬细胞表型[6]。

1.2 多核巨细胞

来自单核/巨噬细胞系的细胞是最先接触到β-TCP等植入生物材料的细胞类型之一，在向经典的M1或M2型巨噬细胞分化后，融合成破骨细胞或多核巨细胞(MNGCs)[10]。体外研究表明，MNGCs可产生大量促炎细胞因子，包括IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8和巨噬细胞炎症蛋白MIP-1β[3],能介导生物材料降解。Kucera等[10]对7例植入β-TCP治疗骨缺损的患者进行了组织学检查，吞噬生物材料的MNGCs和附着在生物材料上的破骨细胞证实了二者都有助于β-TCP的吸收，在植入后208周仍观察到该生物材料的颗粒。最近研究发现MNGCs在植骨材料周围能表达类似于M2型巨噬细胞的标志，提示了MNGCs可能与伤口愈合和组织再生有关。Jessen等[11]在人体组织学样本中发现，MNGCs大量聚集在植骨材料周围，移植部位的骨量水平高于平均水平，其MNGCs的数量也明显高于平均水平。

1.3 T细胞

在骨免疫学领域，T细胞在炎症性关节炎和牙周炎等疾病中对破骨细胞活化和骨吸收的影响已被证实[12]。在缺乏功能性淋巴细胞的小鼠，即RAG-1缺陷小鼠中进行的研究表明，T细胞确实可能在骨再生中发挥作用，RAG-1缺陷小鼠的骨痂显示出较低的骨性标记水平[13]。另外，CD4+T细胞比CD8+细胞毒T细胞对成骨更有促进作用[12]。Th17和Treg亚群分别被认为是典型的促炎和抗炎CD4+T细胞表型。研究发现，β-TCP能通过来源于Th17细胞的可溶性因子IL-17A和IL-17F上调MSCs成骨标志物的表达，在直接暴露于MSCs时同样表现出强烈的成骨作用[12]。另外，Treg是已知的体外和体内破骨细胞形成的抑制剂[14],在骨髓间充质干细胞介导骨再生过程中，Treg加入后骨形成水平提高。这些研究表明在β-TCP介导成骨过程中T细胞有着不可忽视的作用。

2、信号通路

许多研究表明免疫分子在β-TCP介导成骨过程中发挥直接和关键的作用，本文将从Ca2+与炎症信号通路、NF-κB通路和BMP信号通路3个方面来介绍，虽然更确切的分子机制尚未完全阐明，但了解免疫信号机制有助于优化β-TCP的骨免疫学特性和生物相容性。

2.1 Ca2+炎症信号通路

钙是β-TCP的主要成分之一，已被证实参与某些炎症信号传导途径，非典型Wnt5A/Ca2+信号通路可增强炎症反应，当Wnt5A与Fz5结合时，通过钙离子-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)和蛋白激酶C激活Wnt/Ca2+信号通路，最终通过转录因子NF-κB上调下游炎性细胞因子表达[15]。CaMKⅡ能与巨噬细胞中的环腺苷酸反应元件结合蛋白(CREB)作用，并激活环氧化酶-2(COX-2)以产生促炎症激素前列腺素E2(PGE2)。高浓度的细胞外Ca2+也被发现能够激活钙感应受体(CaSR)信号级联导致Wnt5A的产生，抑制NF-κB通路，降低TNF-α的表达，并通过Wnt5A/Ror2信号途径下调TNFR1,从而减轻炎症反应[16]。

2.2 NF-κB信号通路

在细胞的炎症反应、免疫应答等过程中NF-κB信号通路起到关键性作用，NF-κB的错误调节会引发自身免疫病、慢性炎症以及癌症等。一些研究也证实了NF-κB通路在巨噬细胞极化过程中的作用，在M1极化过程中，NF-κB途径被激活，从而激活了TNF-α、IFN-γ等M1相关因子的转录。研究发现在β-TCP浸提液刺激下，NF-κB通路受到了抑制，进而降低了EZH1的表达，从而调节巨噬细胞向M2向极化，并提高了成骨相关基因表达及成骨向分化[17]。不仅成骨细胞能表达RANKL(NF-κB激动剂),激活的T细胞和中性粒细胞都能表达RANKL,RANKL可以和破骨细胞前体上的RANK相结合，在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和RANKL的刺激下，巨噬细胞能分化为破骨细胞[6]。

2.3 BMP信号通路

BMPs作为多功能旁分泌生长因子，属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族，在生物材料促成骨过程中发挥着重要作用[18]。在BMP蛋白中，研究发现β-TCP提取物显著上调巨噬细胞表达BMP-2,释放的BMP-2可以与BMP-R2结合，从而激活SMAD5,激活的SMAD5可以与SMAD4形成复合物，该复合物转移到细胞核中，促进Dlx5的表达，Dlx5已被证实诱导了Runx2的表达，从而促进成骨[19]。β-TCP刺激后巨噬细胞BMP-2上调的机制尚未明确。BMP-2作为骨诱导剂的临床应用帮助越来越多的患者在临床上实现骨再生。Boudrieau等[20]在β-TCP/胶原复合物的基础上再加入rh-BMP2,用于面部严重畸形犬的缺损修复却表现出另一种协同作用，材料植入3个月后，缺损区便有新生骨形成，6个月后新生骨血管化。然而BMP-2产品的上市伴随着各种并发症和不良反应的报道，为了优化治疗的有效性和安全性，BMP-2治疗策略仍需进一步改善。

3、β-TCP复合材料

β-TCP有着诸多缺陷如生物力学强度不佳，单独使用时只有骨传导性而缺乏骨诱导性，近二十年来许多学者着力于对其改性研究，使其同时具有骨传导和骨诱导作用，让免疫微环境向有利于成骨而非破骨的方向转变，使其对新骨生成的促进效果显著，更加符合临床应用要求。

3.1 双向磷酸钙生物陶瓷(BCP)

近年来双向磷酸钙生物陶瓷的研究逐渐成熟，通过调节β-TCP/HA的比例得到不同生物活性的BCP,降解速度快的β-TCP会快速溶解在多孔的HA中，剩余的多孔HA结构中可以让组织长入和新骨形成。Boule等[21]发现小于20μm的BCP微粒降低了巨噬细胞的活性，增强了巨噬细胞分泌促炎性细胞因子(IL-6和TNF-α)的能力。Silva等[22]分析BCP微粒对人巨噬细胞运动和分泌的影响，他们观察到细胞和BCP颗粒相互附着，连接到BCP的细胞内游离Ca2+浓度更高，并且向培养基中分泌Ca/P颗粒，分泌颗粒的Ca/P比值为1.64,与HA相似，这些分泌的颗粒可以形成有利于巨噬细胞进一步粘附的过渡区。

3.2 骨髓间充质干细胞(BMSCs)

在β-TCP支架上添加干细胞使得只有骨传导性的材料同时具有骨诱导性能，模仿活体组织的结构和生理功能。骨BMSCs是骨和软骨的前体细胞，能够在体外发育为成纤维母细胞集落形成细胞，并在体内再生异位骨组织[23]。除了再生特性外，BMSC还具有独特的免疫调节特性，与β-TCP相结合，诱导骨组织修复。BMSC可以通过分泌M2型巨噬细胞诱导因子，如IL-4、IL-13、IL-6和前列腺素E2[24],将巨噬细胞M1/M2平衡向M2型调节。BMSCs还能调节巨噬细胞的趋化性，激活的BMSCs显著增加了包括CCL2在内的多种趋化因子的分泌，其介导的巨噬细胞的募集，是免疫调节过程的关键[25]。Chen等[7]研究了β-TCP对小鼠巨噬细胞系RAW264.7和人MSCs相互作用的影响，用β-TCP提取物刺激支架上的巨噬细胞，发现巨噬细胞呈M2表型，BMP-2和VEGF的产生增加，增加了BMSCs成骨标志物和基质矿化的表达。

3.3 镁(Mg)

镁是一种可降解的生物相容性金属，其机械结构与骨骼相似，降解速度较快，已被提出作为可生物降解的金属骨生物材料应用于骨科[26]。包覆β-TCP的Mg支架降解速度较Mg本身慢，两者相结合可以使复合物具有两种材料的有益特性，并具有有利于成骨的骨免疫调节特性。Chen等[27]发现巨噬细胞在Mg-β-TCP支架作用下向M2表型转化，这可能是由于Toll样受体信号通路受到抑制所致，VEGF和BMP2明显上调，说明β-TCP修饰的Mg支架中巨噬细胞具有促成骨的特性，BMSCs的成骨分化进一步证实了这一点。Lai等[28]使用具有成骨功能的镁粉，聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)和β-TCP作为支架的原材料，在兔模型中发现在术后4周能促进血管生成，在术后12周有明显的新骨生成并且具有良好的机械性能。这些结果提示包覆Mg的β-TCP可以调节支架的骨免疫调节特性。

4、展望

经过科研及临床工作者近四十年的不断努力，β-TCP作为骨组织工程材料在基础研究及临床应用中取得了很大的进步，免疫反应是β-TCP成骨过程中不可忽视的环节，如今趋向于让其从“惰性”转变为“具有免疫调节作用”,甚至鼓励免疫反应的出现而不是抑制免疫反应。了解免疫细胞与骨细胞之间的关系，β-TCP介导的免疫反应的机制以及植入后所诱导的免疫环境对成骨的影响，对于进一步改善β-TCP的骨免疫调节性能是十分重要的，为最佳的骨整合提供平衡骨生成和破骨生成的条件。

参考文献:

[2]史秀娣,马红梅.口腔生物材料对机体巨噬细胞生物学行为影响研究进展[J].中国实用口腔科杂志,2016,9(12):756-760.

[4]李明政,肖宇,吴珍珍,等.巨噬细胞在材料诱导成骨中作用的研究进展[J].口腔医学研究,2017,33(10):1123-1126.

文章来源：单宇华,陈振琦.β-磷酸三钙骨免疫学特性的研究进展[J].口腔医学研究,2021,37(09):787-790.