骨缺损是由骨折、成骨不全或骨质疏松等原因引起的骨科常见疾病。自体骨移植是理想的治疗手段，具有骨传导和骨诱导的特性，但风险高、骨源少且术后在供体部位易出现严重疼痛和并发症[1]。骨组织工程是一种有前景的替代疗法，将生物材料植入骨缺损部位，利用支架来支持细胞生长和细胞外基质沉积，以再生新鲜的骨组织。随着对支架材料的不断深入研究，国内外学者发现，将成骨诱导剂负载于支架材料上，可以获得更好地治疗效果[2,3]。淫羊藿是我国传统中药，具有悠久的历史，淫羊藿苷(icariin, ICA)是一种典型的黄酮醇苷，是淫羊藿的主要活性成分。在现代研究中，ICA可以治疗骨质疏松症，具有刺激成骨细胞增殖活性、抑制破骨细胞形成、防止骨质流失、增加骨矿物质密度等作用[4,5,6]。因其各种有益的特性，该植物已被收录于《中华人民共和国药典》,其中ICA的含量是评价淫羊藿药材的关键质量标准[7]。ICA安全、无毒、价格低廉、具有成骨潜力，且无异位骨形成问题，这使其非常适合应用于骨缺损的修复。本文就ICA修复骨缺损及其作用机制加以概述。

1、负载ICA的材料修复骨缺损

研究报道，ICA可以显著促进成骨细胞的分化和成熟，是一种强效的骨诱导剂[8]。ICA可以通过生物材料进行局部递送，促进骨组织的修复与生成，并且ICA能够负载于多种支架材料上，具有优良的相容性。

1.1负载ICA的天然及衍生生物材料

小肠黏膜下层(small intestine submucosa, SIS)是一种非细胞、天然存在的胶原细胞外基质材料，含有多种生物活性因子，SIS具有优异的生物相容性，有利于各种细胞的附着、增殖、迁移，但其本身缺乏成骨诱导性，这限制了其在修复骨缺损中的应用[9]。Li等[10]发现，将ICA加载到SIS材料上，植入到小鼠颅骨缺损中，与对照组相比，在支架植入第8周时增强了骨形成。体外实验表明，经含有ICA的支架处理后，多个成骨分化标志物的表达增加，且没有明显的细胞毒性，并且ICA在SIS支架上的持续释放超过30 d。之后，Li等[11]又研发出新的方案，利用ICA在SIS上培养衍生的骨诱导细胞外基质，生成一种新的天然结构，这种结构比传统的ICA-SIS支架具有更好的生物相容性，包括细胞粘附、细胞存活和细胞增殖，表现出更强的骨生成能力，同时也可以促进血管生成。

透明质酸(hyaluronic acid, HA)是软骨细胞外基质的重要的组成部分，参与细胞的增殖和形态发生。一项研究显示，通过给兔子灌胃ICA制备的血清，与HA结合形成的生物材料，可以促进体内软骨缺损的修复，并有望增强蛋白聚糖和胶原蛋白的生成[12]。富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP)含有丰富的生长因子，冻干的PRP作为ICA的载体，可以将ICA持续释放到受损的骨-腱部位，从而加速其愈合，增强骨-腱部位的机械强度和刚度[13]。

1.2负载ICA的人工合成材料

随着国内外学者的不断深入研究，开发出多种用于修复骨缺损的材料，有越来越多的研究报道了ICA与人工合成支架材料结合复合物在骨缺损修复方面的应用。将ICA加载到羟基磷灰石/海藻酸盐(hydroxyapatite/alginate, HAA)多孔复合支架，结果显示，ICA-HAA促进了骨髓间充质干细胞的增殖，且不产生细胞毒性，体内兔桡骨缺损实验表明，与单纯应用HAA相比，ICA-HAA能够更好的修复骨缺损，表现出优异的骨形成能力，这主要与其上调了多个成骨基因、激活Wnt信号通路并且抑制了体内破骨细胞活性相关[14]。磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement, CPC)是骨组织工程的材料之一，负载ICA的CPC填充到小鼠颅骨骨缺损中，结果显示，治疗组能显著提高新骨形成和新骨厚度，并且在ICA诱导的新骨中能观察到明显的血管形成[15]。ICA能与多种支架材料表现出良好的相容性。将ICA负载到含有大鼠脂肪干细胞的生物活性玻璃上，制备成新型的骨缺损修复支架，结果表明，该修复材料能够促进脂肪干细胞成骨分化，促进骨形成[16]。Wu等[17]发现，含有ICA的壳聚糖/羟基磷灰石复合材料，在体内表现出良好的骨传导和骨诱导，它可以填补缺损骨段，促进早期新生骨组织的形成，且ICA控释效果良好，体外90 d后仍能保持释放。Fan等[18]开发出一种新型的装载ICA的壳聚糖/羟基磷灰石复合材料，该复合物能够控制ICA的释放动力学，以增强骨修复，体外生物活性测定表明，负载ICA的复合物还具有一定的生物活性。

综上所述，ICA能够负载于多种生物材料，具有良好的生物相容性，且控释效果和骨诱导能力良好。Wu等[19]发现，局部递送ICA能够显著增强骨修复，全身给药促进了颅骨骨缺损部位血管生成，而两者联合使用能够更好地促进骨形成，修复缺损骨区域。

2、ICA修复骨缺损的作用机制

骨缺损的修复是一个复杂的过程。ICA可以通过多种形式、各种信号通路途径和细胞信号转导等方式修复骨缺损，本文将从骨形成、骨吸收、软骨形成、血管生成和抗炎作用方面进行阐述。

2.1骨形成

2.1.1成骨细胞：

成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，参与骨骼的生成与重建过程。Huang等[20]发现，ICA可以促进成骨细胞的增殖。体外实验结果表明，高浓度的ICA可增强ALP活性、矿化和成骨细胞增殖，这可能与其在BMP-2/Runt2信号通路中调节作用相关。Xie等[21]在胶原水凝胶中培养大鼠颅骨成骨细胞，通过FDA/Pi染色、HE染色和扫描电镜，观察成骨细胞的生长状态。结果发现，ICA浓度为1×10-5、1×10-6、1×10-7 mol/L时，均能提高培养基中碱性磷酸酶的活性，促进成骨细胞的分化与成熟，且浓度为1×10-6 mol/L时，提高了BMP-2、RUNX-2、Osterix蛋白的表达水平。也有学者提出，ICA通过激活成骨细胞初级纤毛中的cAMP信号通路，促进骨形成[22],此结论在随后的研究中也得到了证实[23]。ICA是一种植物雌激素，实际上，ICA确实能够激活雌激素受体，具备雌激素样活性[24]。Zhou等[25]的研究证实，ICA通过提高成骨细胞中IGF-1信号的快速诱导，来激活雌激素受体和Akt,从而促进骨形成。同时，ICA对成骨细胞具有一定的保护作用，实验结果显示，在体外缺氧的条件下，ICA降低了成骨细胞的氧化应激和凋亡，保存了成骨细胞的存活能力和成骨潜能，并且能够增加RUNX-2、OSX和BMP-2基因表达、碱性磷酸酶活性和矿化结节[26]。

2.1.2骨髓间充质干细胞：

骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)是一种成体多能干细胞，具有成骨潜能。ICA能够促进BMSCs发生成骨分化、软骨分化和细胞增殖，从而参与骨缺损修复的过程。李磊等[27]通过培养兔BMSCs进行不同浓度ICA和不同时间下诱导干预，发现1μmol/L和48 h条件下，BMSCs的增殖和成骨分化效果最佳。张锦明等[28]提出，ICA促进BMSCs的成骨分化作用与其促进OPN和BSP的表达相关。蔡叶等[29]采用全骨髓贴壁法提取BMSCs,结果发现，ICA通过调节成骨相关信号通路Foxo3a/β-catenin表达，发挥其成骨活性。此外，ICA具有促进BMSCs的成骨分化的作用也被其他学者通过各种体内和体外实验所证实[30,31]。ICA不仅能诱导BMSCs发生成骨性分化，同时也可以抑制其分化为脂肪细胞，这可能与ICA发挥雌激素样作用有关[32]。也有学者研究发现，ICA通过激活Wnt/β-catenin2、ALP和OPN的表达，抑制PPARγ、Adipsin和FABP4的表达从而促进其成骨分化，抑制其成脂分化[33]。ICA对BMSCs还具有一定的保护作用，Liu等[34]发现，ICA通过抑制与MAPK信号通路相关的内质网应激介导的自噬，保护免BMSCs免受缺氧、血清剥夺诱导的细胞凋亡。ICA对BMSCs的软骨分化同样具有促进作用，Jiao等[35]通过体外实验发现，ICA促进BMSCs的软骨分化和细胞增殖，促进BMSCs中COL2A1和BMP-2的表达，体内实验证明，ICA能够修复骨缺损表面的软骨样组织。Tang等[36]发现，ICA与BMSCs的联合应用，促进了GGR、BMP2和COL2A1蛋白在BMSCs中的表达能够更好地修复兔关节软骨缺损。

2.2骨吸收

破骨细胞是骨吸收的主要功能细胞，破骨细胞的分化、功能和凋亡影响着骨骼的生成、修复。建立小鼠成骨细胞-破骨细胞共培养系统，结果显示，ICA能够促进成骨细胞活性，抑制破骨细胞活性，降低BMSCs的脂肪分化水平，展现出ICA促进骨形成和抑制骨吸收的双重活性[37,38]。Wang等[39]发现，ICA可以通过调节OPG/RANKL来降低破骨细胞的数量和活性。Kim等[40]提出，ICA也能够通过抑制RKF-6的表达和ERK的磷酸化，从而抑制破骨细胞活性。Hsieh等[41]研究发现，ICA通过抑制p38和JNK通路的激活，从而减小破骨细胞的体积，且浓度为1×10-8 mol/L时，体积减小明显，同时多项破骨细胞生成指标降低，如抗酒石酸酸性磷酸酶、酸性磷酸酶等。另一项报道显示，ICA抑制骨吸收是通过下调RAKL-p38/ERK-NFAT信号通路，抑制破骨细胞分化，从而防止骨溶解[42]。综上研究表明，ICA能够抑制破骨细胞的分化、增殖、活性、体积等，从而抑制骨吸收，这也从另一个角度展现出ICA在骨修复方面的积极作用。

2.3软骨形成

骨的形成主要包括两种形式，膜内骨形成和软骨内骨形成，对于较大面积的骨缺损修复过程，则主要以软骨内骨形成为主，软骨内骨的形成可以扩大软愈伤组织体积，连接骨折端，并通过软骨细胞的一系列变化(包括快速增殖、成熟和肥大)来填补缺口[43]。ICA则是一种安全有效的软骨生成代谢剂。一项研究结果表明，将BMSC在软骨形成培养基中的自组装肽纳米纤维水凝胶支架中培养3周，在整个培养期间将淫羊藿苷以1×10-5 mol/L的浓度添加到培养基中。结果表明，ICA显著增强了软骨细胞外基质合成以及胶原蛋白II和SOX9的基因表达水平，并且能够促进BMSCs中软骨细胞的圆形形态，防止进一步肥大分化[44]。Yang等[45]也进行了类似的研究，将ICA负载于透明质酸和胶原水凝胶复合物观察其促进骨软骨界面修复的能力，结果显示，ICA能够同时促进软骨生成和成骨，检测发现成软骨基因的表达水平显著上调，相关的GAG和II型胶原的基质合成显著增强，同时成骨基因RUNX2、ALP和OCN也在早期上调，相应的体内研究显示，负载ICA的复合材料促进兔软骨缺损骨软骨界面的重建。软骨内的快速骨化有利于骨缺损部位的修复，ICA对软骨形成的有益影响，使其能够更好地治疗骨缺损。

2.4血管生成

骨缺损的修复有赖于受损局部的血管生成和血管化，良好充足的血供可以加速骨形成和骨整合。研究表明，ICA能够降低MMP-2、MMP-9活性，增加组织良好的胶原蛋白沉积，减少炎症并改善血管生成[46]。载有ICA的硫酸β-环糊精生物材料还可以实现组织工程血管的抗凝和快速内皮化，能够保持血管长期通畅[47]。Li等[48]研究发现，ICA促进血管生成是通过激活自噬途径，上调了TGFβ1的表达。ICA还可以保护因氧化性低密度脂蛋白引起的血管内皮细胞损伤，这可能与其调节Bcl-2和caspase-3的蛋白表达水平相关[49]。此外，ICA也能在一定程度上抑制由铁死亡导致的血管内皮细胞凋亡[50]。

2.5抗炎作用

抗炎在骨愈合中起着关键作用，炎症会影响软骨愈伤组织骨化，从而减缓骨愈合的速率[51]。例如，牙槽骨缺损的治疗尤其要注意控制炎症[52]。ICA在抗炎作用方面展现出良好的效果。一项体外实验结果显示，将ICA负载到一种仿生软骨支架上，观察ICA介导的软骨形成和对兔软骨细胞炎症的改善作用。结果显示，在模拟炎症存在的情况下，ICA能够减少软骨细胞纤维化，有效下调IL-6、IL-1和INOS炎症相关基因的表达，上调软骨形成基因SOX9、CII的表达[53]。另一项研究显示，负载ICA的壳聚糖水凝胶不仅表现出良好的抗炎作用，还具有良好的细胞相容性，加速软骨细胞增殖，促进软骨形成，这可能与IL-1β,IL-6,TNF-α和TUNEL表达下调有关[54]。另外，Bai等[55]研究发现，ICA可以激活自噬，对衰老的巨噬细胞有显著的抗炎作用，并且能够恢复衰老的BMSCs继续发挥成骨作用。ICA对急性炎症反应同样具有抗炎作用。Xu等[56]通过体内外实验证明，ICA对脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)诱导的急性炎症反应具有保护作用，主要通过激活PI3K/AKT,抑制NF-KAB通路。最近研究显示，ICA的衍生物同样具有抗炎特性[57,58]。

3、总结与展望

如何修复大面积骨缺损一直是国内外学者研究的重点。ICA能够促进软骨、血管等生成，尤其在诱导骨形成方面效果显著。将ICA负载于多种生物材料，通过局部递送的方式同时联合口服给药可以更有效的促进骨形成，从而修复骨缺损。并且无论是天然生物材料还是人工合成材料，ICA都能够发挥出良好的控释效果。此外，本文对ICA发挥成骨作用的机制进行了初步归纳，主要通过上调BMP-2、Runx2、OPG/RANKL、TGFβ1比值的表达，调节BMP-2/Smad4、MAPK、Wnt信号转导通路等。

总之，ICA作为一种中药有效活性成分，具备较强的成骨能力、局部控释效应、安全性高等优势，在治疗骨缺损方面能够表现出显著的效果，值得被学者们进一步深入研究和在临床推广使用。

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基金资助:甘肃省自然科学基金项目(22JR5RA020);军队后勤自主科研项目(2023HR22-07);联勤保障部队第九四○医院实验室培育项目(2021yxky081);兰州市科技计划项目(2003-8-1);

文章来源:杨世超,宋慕格,李幸,等.淫羊藿苷修复骨缺损及其作用机制研究[J].中国骨质疏松杂志,2024,30(05):720-724+744.