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罗哌卡因对老年大鼠胫骨骨折术后认知功能障碍和神经突触的影响

2024-05-27 31 上传者：管理员

摘要：目的研究罗哌卡因对老年大鼠胫骨骨折术后认知功能障碍和神经突触的影响。方法将SD雄性大鼠分为假手术组、模型组和低、中、高剂量实验组。假手术组大鼠在局部麻醉下切开皮肤并缝合，其余4组进行开放性胫骨骨折手术，其中假手术组、模型组均给予七氟烷麻醉，低、中、高剂量实验组在七氟烷麻醉基础上给予0.5、1.0、2.0 mg•kg-1罗哌卡因。术后7 d各组大鼠进行旷场实验和Morris水迷宫实验，评估Longa评分，用免疫组化法检测大鼠海马组织突触素1(Syn1)水平，用蛋白质印迹法检测N-甲基-D-天冬氨酸受体2B(NMDAR2B)、钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)和Syn1蛋白的表达水平。结果假手术组、模型组和低、中、高剂量实验组Longa评分分别为0、(3.50±0.71)、(2.80±0.63)、(2.20±0.63)和(0.90±0.32)分，Syn1的累积光密度分别为0.56±0.09、0.25±0.03、0.34±0.03、0.42±0.03和0.50±0.05,Syn1蛋白相对表达水平分别为1.08±0.12、0.42±0.05、0.55±0.07、0.72±0.06和0.86±0.05,NMDAR2B蛋白相对表达水平分别为1.28±0.13、0.51±0.07、0.69±0.06、0.84±0.07和1.02±0.11,CaMKⅡ蛋白相对表达水平分别为0.94±0.08、0.36±0.04、0.50±0.06、0.71±0.06和0.86±0.06。假手术组与模型组的上述指标比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);模型组与低、中、高剂量实验组的上述指标比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论罗哌卡因可改善老年大鼠胫骨骨折术后认知功能障碍和神经突触。

关键词：
关节内骨折
神经突触
罗哌卡因
胫骨骨折
认知功能障碍
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胫骨骨折是老年群体常见关节内骨折，据调查数据显示，我国胫骨骨折发生率占全身骨折的0.9%,随着人口老龄化进程加快，以及老年群体骨强度降低及骨质量减少等原因，胫骨骨折发生率逐年升高[1]。胫骨骨折多需要手术进行治疗，但手术过程需要麻醉，由于老年群体自身身体素质差、耐受性有限等因素，麻醉和手术对机体造成一定刺激，可增加术后认知功能障碍发生风险[2]。罗哌卡因是临床常用新型长效酰胺类局麻药，具有毒性低、作用时间久和良好镇痛效果，临床多用于外科和妇产科[3]。有研究报道显示，罗哌卡因可改善创伤性脑损伤大鼠认知功能，并提高机体抗氧化和抗炎能力[4]。本研究旨在探讨罗哌卡因对老年大鼠胫骨骨折术后认知功能障碍和神经突触的影响。

1、材料与方法

1材料

动物SPF级SD雄性大鼠，鼠龄23个月，体质量550～600 g,福建中医药大学提供，动物许可证号：SYXK(闽)2019-0007。本实验经福建医科大学动物伦理委员会批准(伦理批号：IACUC FJMU2023-Y-0516)。

药品与试剂七氟烷，规格：每支250 mL,批号：20220220,批准文号：国药准字H20173007,上海恒瑞医药有限公司生产；罗哌卡因，规格：每支20 mL/178.8 mg,批号：20210125,批准文号：国药准字H20060898,辰欣药业股份有限公司生产。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)试剂盒、甘氨酸(glycine, Gly)试剂盒，均购自武汉基因美生物科技有限公司；谷氨酸(glutamic, Glu)试剂盒、多巴胺(dopamine, DA)试剂盒，均购自南京建成生物研究所；钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)抗体、N-甲基-D-天冬氨酸受体2B(N-methyl-D-aspartate receptor 2B,NMDAR2B)抗体、突触素1(Synapsin 1,Syn1)抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydroge-nase, GAPDH)抗体，均购自英国Abcam公司。

仪器MK3酶标仪、Mini-PROTEAN电泳仪、Trans-Blot Turbo半干转印槽转膜仪，均为美国Bio-Rad公司产品。

2实验方法

2.1模型构建、动物分组与给药方法[5]5]

将50只SD老年大鼠分为假手术组、模型组和低、中、高剂量实验组，每组10只。除假手术组外，均进行开放性胫骨骨折手术，其中假手术组、模型组均给予七氟烷麻醉，低、中、高剂量实验组在七氟烷麻醉基础上给予0.5、1.0、2.0 mg·kg-1罗哌卡因。骨折手术具体操作：大鼠经麻醉诱导至正反射消失，无菌条件下对左侧胫骨剃毛、常规消毒，将其固定在手术台(仰卧位),并观察大鼠呼吸频率、鼻唇颜色，用放大镜在胫骨外侧切1.5～2 cm切口，使胫骨骨干暴露，在胫骨前缘插入5 cm注射器针头，旋转打入胫骨骨干，用手术刀在胫骨中上1/3截骨造成骨折，碘伏清洗伤口，缝合皮肤。假手术组大鼠在局部麻醉下切开皮肤并缝合，不进行手术。

2.2旷场实验检测活动总路程、中央区活动时间、跨格次数[6]6]

术后7 d,各组大鼠均进行旷场实验。选取高40 cm、长和宽100 cm纸箱，底面划分为面积相等的25个方格(20 cm×20 cm),保证弱光、环境安静，在箱面安装一个摄像头，墙壁为外周格，其余为中央格。将大鼠放在纸箱底部中央，做好标记，观察大鼠在中央区域活动时间、活动总路程、跨格次数，总时长5 min。每次实验结束后清洗旷场内部和地面。

2.3 Morris水迷宫实验检测活动总路程、中央区活动时间、跨格次数、潜伏期[7]7]

造模后7 d进行定位导航和空间探索实验，制备一个圆形水池，直径170 cm、高80 cm,并标记东西南北，分为4个象限，目标象限方式为一个平台，水温控制在(25±2)℃。将大鼠面向池壁，随机从4个入水点放入，观察大鼠60 s穿越平台次数。撤去平台，以在Ⅲ象限中点为入水点，大鼠面向池壁放入水中，自由游泳60 s,摄像系统即软件分析各组大鼠逃避潜伏期、游泳总距离、游泳速度。

2.4 Longa评分评估大鼠神经功能[8]8]

用Longa评分评估大鼠神经功能。0分：完全正常；1分：轻度缺损；2分：大鼠左侧前爪不能完全伸展，神经功能存在一定缺损；3分：大鼠两侧爪不能完全伸展，神经功能受损严重；4分：大鼠爪无法伸展，神经功能缺损严重。

2.5酶联免疫吸附测定法检测血清神经递质的水平[8]8]

取各组大鼠血清，离心后收集上清液，参照酶联免疫吸附测定法试剂盒步骤测定GABA、Gly、DA、Glu的表达水平。

2.6免疫组化法检测大鼠Syn1水平[9]9]

各组大鼠处死后取海马组织，制成厚度为5μm切片，过氧化氢孵育，多聚甲醛固定，滴加修复液后经微波高火，常温冷却。加胎牛血清封闭培养，滴加抗体Syn1(1∶500)在4℃孵育24 h,次日滴加二抗(1∶2 000)在室温孵育1 h。经二氨基联苯胺染色、苏木精复染，脱水、中性树胶封片。以Image Pro图像进行分析，计算平均光密度值，以累积光密度(integrated optical density, IOD)值表示Syn1表达强度。

2.7蛋白质印迹(Western blot)法检测NMDAR2B、CaMKⅡ、Syn1的蛋白表达水平[10]10]

取各组大鼠海马组织剪碎，制备匀浆液并加入裂解液，低温匀浆离心5 min取上清液，用二喹啉甲酸法测定样品浓度。取样品与等体积2×上样缓冲液混合，煮沸5 min,进行凝胶电泳处理，转膜、封闭1 h,加入NMDAR2B(1∶500)、CaMKⅡ(1∶500)、Syn1(1∶500)和β-actin(1∶1 000)在4℃孵育24 h,次日滴加二抗(1∶2 000)在室温孵育1 h,化学发光液曝光显色。用Image Pro分析蛋白条带。

3统计学处理

用SPSS 27.0软件进行统计分析。数据用

表示，多组间比较用单因素方差分析，事后比较用LSD-t检验。

2、结果

1各组大鼠旷场实验结果

假手术组、模型组均给予七氟烷麻醉，低、中、高剂量实验组在七氟烷麻醉基础上给予0.5、1.0、2.0 mg·kg-1罗哌卡因。

与假手术组相比，模型组的活动总路程、中央区活动时间、跨格次数均显著降低(均P<0.05);与模型组相比，低、中、高剂量实验组的活动总路程、中央区活动时间、跨格次数均显著增加(均P<0.05)。结果见表1。

2各组大鼠Morris水迷宫实验结果

与假手术组相比，模型组的游泳速度、游泳总距离、穿越平台次数均显著降低，潜伏期明显延长(均P<0.05);与模型组相比，低、中、高剂量实验组的游泳速度、游泳总距离、穿越平台次数均显著增加，潜伏期均明显缩短(均P<0.05),见表2。

3各组大鼠Longa评分的比较

假手术组、模型组和低、中、高剂量实验组的Longa评分分别为0、(3.50±0.71)、(2.80±0.63)、(2.20±0.63)和(0.90±0.32)分。与模型组相比，低、中、高剂量实验组的Longa评分均显著降低(均P<0.05)。

表1各组大鼠旷场实验比较

表2各组大鼠Morris水迷宫实验比较

表3各组大鼠血清神经递质的比较

4各组大鼠血清神经递质的比较

与假手术组相比，模型组的GABA、Gly、DA均显著降低，Glu显著升高(均P<0.05);与模型组相比，低、中、高剂量实验组的GABA、Gly、DA均显著升高，Glu显著降低(均P<0.05),见表3。

5各组大鼠海马组织Syn1蛋白表达水平的比较

假手术组、模型组和低、中、高剂量实验组的Syn1 IOD分别为0.56±0.09、0.25±0.03、0.34±0.03、0.42±0.03和0.50±0.05,Syn1蛋白相对表达水平分别为1.08±0.12、0.42±0.05、0.55±0.07、0.72±0.06和0.86±0.05。与假手术组相比，模型组海马组织Syn1均显著降低(均P<0.05);与模型组相比，低、中、高剂量实验组海马组织Syn1均显著升高(均P<0.05)。

6各组大鼠海马组织NMDAR2B、CaMKⅡ蛋白相对表达水平的比较

与假手术组相比，模型组海马组织NMDAR2B、CaMKⅡ蛋白相对表达水平均显著降低(均P<0.05);与模型组相比，低、中、高剂量实验组海马组织NMDAR2B、CaMKⅡ蛋白相对表达水平均显著升高(均P<0.05),见表4和图1。

表4各组大鼠海马组织NMDAR2B和CaMKⅡ比较

图1海马组织NMDAR2B和CaMKⅡ的蛋白表达情况

3、讨论

术后认知功能障碍主要是指患者在接受手术和麻醉后所出现的一种中枢神经系统并发症，临床表现为记忆力降低、智力下降、理解能力和沟通能力等受损，可持续数周或数月，部分患者可进展为永久性认知功能障碍，严重时可丧失生活自理能力[11]。有研究报道，术后认知功能障碍最早在心脏术后患者中发现，但近年研究发现，其在骨折术后发生率较高[12]。

罗哌卡因是一种新型左旋长效局部麻醉药，具有麻醉和镇痛双重作用，近年研究报道显示，罗哌卡因对脑缺血、血脑屏障有保护作用，可明显提高脑组织抗炎能力[13]。临床研究结果表明，罗哌卡因可改善老年骨折患者认知功能障碍，并减轻术后疼痛程度[14]。本研究结果发现，胫骨骨折术中给予罗哌卡因处理可增加大鼠活动总路程、中央区活动时间、跨格次数、游泳速度、游泳总距离、穿越平台次数，并缩短潜伏期，增加Longa评分，具有一定剂量效应关系，表明罗哌卡因可改善老年大鼠胫骨骨折术后认知功能障碍。术后认知功能障碍还可影响神经递质含量变化，而神经递质主要包括氨基酸类(GABA、Gly、Glu等)和单胺类(DA等),机体发生认知功能障碍后，可引起GABA、Gly、DA释放减少，可促进Glu释放增多，进一步加重术后认知功能障碍[15]。本研究结果发现，罗哌卡因可呈剂量效应关系增加GABA、Gly、DA表达，并降低Gly表达，表明罗哌卡因可通过改善神经递质因子释放情况进而改善老年大鼠胫骨骨折术后认知功能障碍。

本研究中模型组内Syn1、NMDAR2B、CaMKⅡ表达降低，而罗哌卡因呈剂量关系增加Syn1、NMDAR2B、CaMKⅡ表达，表明罗哌卡因可改善老年大鼠胫骨骨折术后神经突触，有助于术后神经功能恢复。

本研究提示，罗哌卡因可改善老年大鼠胫骨骨折术后认知功能障碍和神经突触，有助于神经功能恢复。

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