近年来，男性骨质疏松症逐渐成为科研人员和临床医生关注的热点[1]。研究显示，与女性不同，男性骨质疏松症通常发生较晚，多发生在50岁以上的老年人群中，30%～50%的50岁以上男性出现不同程度的骨量减少或骨质疏松，且约1/3骨质疏松继发性骨折发生在男性患者中[2]。研究表明，睾酮是调节骨代谢的重要激素，具有促进骨骼矿化、刺激骨生成以及减少骨吸收的作用。随着年龄的增长，男性的睾酮水平会逐年下降，通常在30岁之后，睾酮水平的下降速度为每年1%左右，睾酮水平的降低直接导致骨质疏松的风险增加[3]。在卵巢切除雌激素不足骨质疏松症模型大鼠的研究中，证明二十五味鬼臼丸能够防治雌激素缺乏导致的骨密度下降，改善骨微细构造，显示其对骨丢失疾病的潜在影响，可用于绝经后骨质疏松症治疗[4-8]。因此，本研究通过睾丸切除构建骨质疏松症模型，观察二十五味鬼臼丸对睾丸切除大鼠骨丢失的保护作用及可能作用机制，为其用于男性骨质疏松症的治疗提供实验依据。

1、材料

1.1动物

30只清洁级3月龄SD雄性大鼠，体质量310～330 g，由西安交通大学医学部实验动物中心提供，合格证号SCXK（陕）2023-002。饲养于室温（24±2）℃，12 h昼夜节律，明暗交替环境，自由摄食饮水。本研究方案已通过青海大学医学院实验动物伦理委员会审核（批准文号PJ202401-33）。

1.2主要药品与试剂

二十五味鬼臼丸由自青海省藏医院自制（青药制备字Z20200876000，0.35 g/丸）。苏木精–伊红（HE）染色试剂盒（货号C0041，北京索莱宝科技有限公司）；血清骨钙素（BGP）、骨保护素（OPG）、骨碱性磷酸酶（BALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、Ⅰ型胶原C端肽 β 特殊序列（β-CTX-Ⅰ）ELISA试剂盒和钙离子（Ca2＋）比色法测试盒（货号为ml002883、ml003271、ml003415、ml003177、ml038228、ml092645，上海酶联生物科技有限公司）；实时荧光定量PCR（RT-PCR）试剂盒（货号AQ601，北京全式金生物技术有限公司）；全蛋白提取试剂盒（货号KGB5303，江苏凯基生物）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（货号bsm-52262R，北京博奥森生物技术有限公司）；矮小转录相关因子2（Runx2）、β-连环蛋白（β-catenin）抗体（货号WL03358、WL0962a，沈阳万类生物科技有限公司）。

1.3主要仪器

Centrifuge 5418R离心机（德国Eppendorf公司）；Nanodrop 2000（美国Thermo公司）；LightCycler96 PCR仪（瑞士Roche公司）；xMark酶标仪（美国Bio-Rad公司）；WT60A组织脱水机（德国Leica公司）；EG1150石蜡包埋机（德国Leica公司）；Ci-S荧光显微镜（日本Nikon公司）；NMC200 Micro-CT（德国Nemo公司）。

2、方法

2.1造模、分组及给药适应性喂养

1周后，通过切除双侧睾丸和附睾构建睾酮缺乏骨质疏松症大鼠模型[9]。大鼠通过小动物麻醉机深度麻醉后，沿腹部中线切开1～2 cm，将睾丸推揉入腹，夹持粉色呈卵圆形睾丸，分离结扎睾丸血管。假手术组采取类似手术方法，仅切除部分脂肪组织。im青霉素，连续3 d预防感染。将30只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组及二十五味鬼臼丸低、中、高剂量（200、400、800 mg/kg）组，每组6只。术后观察1周无异常现象，各组开始ig给药，药物治疗组参照课题组前期研究结果设置浓度梯度[6]。二十五味鬼臼丸200、400、800 mg/kg溶于3 mL生理盐水配制等体积混悬液，二十五味鬼臼丸低、中、高剂量组分别ig 200、400、800 mg/kg二十五味鬼臼丸，模型组和假手术组ig等量生理盐水，相同时间点连续ig 8周。

2.2样本制备

末次给药后，禁食12 h，小动物麻醉机深度麻醉，腹主动脉取血，4℃下3 000 r/min离心15 min（离心半径9.5 cm），取上清，保存于−80℃冰箱；取左侧股骨及腓肠肌，冻存管保存于−80℃冰箱，右侧股骨及腓肠肌置于4%多聚甲醛固定；分离出大鼠精囊生理盐水冲洗并测定质量。

2.3体质量及精囊监测

ig当天记录体质量，随后每周测量1次大鼠体质量变化并记录；末次给药后取材测定精囊质量。

2.4 HE染色观察股骨和腓肠肌组织病理形态多聚甲醛固定

48 h后，生理盐水冲洗右侧股骨和腓肠肌。股骨保存于EDTA脱钙液，37℃恒温脱钙，直至骨组织能被大头针刺穿。腓肠肌仅在多聚甲醛中固定，随后进行下一步处理。股骨和腓肠肌依次进行脱水、包埋、切片、染色和封片后在显微镜下观察形态变化。

2.5 ELISA法检测

BGP、BALP、OPG、TRAP、β-CTX-Ⅰ和Ca2＋水平按照说明书要求加样，用酶标仪在指定波长下（450 nm）检测吸光度（A）值并绘制标准曲线，标准曲线的拟合采用线性回归法，依据标准曲线计算样本中骨代谢指标BGP、BALP、OPG、TRAP、βCTX-Ⅰ和Ca2＋浓度。

2.6 Micro-CT测量股骨远端骨微结构

股骨远端组织用4%多聚甲醛固定过夜，取股骨远端组织固定，Micro-CT扫描参数设置为电压80kV、电流0.06 mA进行样本扫描，使用Recon软件进行三维图像重建，Cruiser软件对各组样本同一目标区域进行数据采集和分析。

2.7 RT-PCR检测股骨

β-catenin、Runx2 mRNA表达引物序列如表1所示，取左侧股骨远端骨组织约100 mg研磨匀浆提取总RNA，用核酸分析仪检测RNA浓度和纯度，按照试剂盒说明书反转录为cDNA，RT-PCR法进行扩增反应，反应条件为95℃预变性3 min，95℃变性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，共45个循环，以GAPDH为内参基因，采用2−ΔΔCt相对定量法计算目的基因相对表达量。表1引物序列

2.8 Western blotting法检测股骨

β-catenin、Runx2蛋白表达取左侧股骨远端骨组织约100 mg研磨匀浆提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，酶标仪测定浓度，依次进行电泳、转膜、封闭，β-catenin（1∶900）、Runx2（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）一抗孵育，使用HRP标记的二抗（1∶10 000）孵育，ECL显色，曝光。使用Image J软件进行条带灰度分析，以GAPDH作为内参，计算目标蛋白相对表达量。

2.9统计学方法

SPSS 25.0软件进行分析，连续变量以x±s表示，若数据满足正态分布且方差齐，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；若方差不齐，两组间比较采用Dunnett’s t检验。

3、结果

3.1各组大鼠体质量和精囊质量变化情况

如图1所示，与假手术组相比，模型组大鼠精囊明显萎缩；与模型组比较，二十五味鬼臼丸低、中、高剂量组大鼠精囊外观无明显变化。如表2所示，8周后，各组大鼠体质量无明显差异，与假手术组相比，模型组大鼠精囊质量显著下降（P＜0.01）；与模型组比较，二十五味鬼臼丸低、中、高剂量干预对大鼠精囊质量的下降无明显影响。

3.2二十五味鬼臼丸对各组大鼠股骨和腓肠肌组织病理形态的影响

如图2所示，与假手术组相比，模型组大鼠骨小梁紊乱且稀疏，肌纤维平均横截面积明显减小（P＜0.01）；与模型组比较，二十五味鬼臼丸低、中、高剂量组大鼠骨小梁丢失程度减轻，肌纤维横截面积均显著增高（P＜0.05、0.01），表明药物治疗后能防治肌肉纤维萎缩。

3.3二十五味鬼臼丸对大鼠血清BGP、BALP、OPG、TRAP、β-CTX-Ⅰ和Ca2＋的影响

如表3所示，与假手术组相比，模型组大鼠BGP、BALP、OPG和Ca2＋水平显著降低（P＜0.01），TRAP和 β-CTX-Ⅰ水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，二十五味鬼臼丸低、中、高剂量组大鼠BGP、OPG水平升高（P＜0.05、0.01），TRAP水平降低（P＜0.05、0.01），二十五味鬼臼丸中、高剂量组大鼠BALP、Ca2＋水平水平升高（P＜0.05、0.01），β-CTX-Ⅰ水平降低（P＜0.01）。

3.4二十五味鬼臼丸对大鼠股骨骨微结构的影响

如图3和表4所示，与假手术组相比，模型组大鼠股骨BMD、BS/BV、Tb.N降低（P＜0.05、0.01），Tb.Sp升高（P＜0.01）；与模型组比较，二十五味鬼臼丸中、高剂量组大鼠BMD和Tb.N升高（P＜0.05、0.01），二十五味鬼臼丸低、中、高剂量组大鼠Tb.Sp降低（P＜0.05）。

图1大鼠精囊展开图

表2二十五味鬼臼丸对睾丸切除大鼠体质量和精囊质量的影响

图2各组大鼠股骨和腓肠肌HE染色

表3二十五味鬼臼丸对血清骨代谢指标的影响

图3大鼠股骨断层扫描

表4二十五味鬼臼丸对去势大鼠股骨远端组织计量学的影响

3.5二十五味鬼臼丸对大鼠股骨 β-catenin、Runx2mRNA表达的影响

如图4所示，与假手术组相比，模型组大鼠 βcatenin、Runx2mRNA表达降低（P＜0.01）；与模型组比较，二十五味鬼臼丸中、高剂量组大鼠组 β-cateninmRNA表达上调（P＜0.05、0.01），二十五味鬼臼丸低、中、高剂量组大鼠Runx2mRNA表达上调（P＜0.01）。

3.6二十五味鬼臼丸对大鼠股骨 β-catenin、Runx2蛋白表达的影响

如图5所示，与假手术组相比，模型组大鼠 βcatenin、Runx2蛋白表达降低（P＜0.01）；与模型组比较，二十五味鬼臼丸低剂量组大鼠 β-catenin蛋白表达上调（P＜0.05），二十五味鬼臼丸低、中、高剂量组大鼠Runx2的蛋白表达上调（P＜0.01）。

图4二十五味鬼臼丸对 β-catenin和Runx2 mRNA表达的影响

图5二十五味鬼臼丸对 β-catenin和Runx2蛋白表达的影响

4、讨论

研究表明，睾酮对于维持骨量具有重要意义[10]。目前，临床防治男性骨质疏松症以睾酮替代疗法为主，但会导致患者前列腺增生、高血压等疾病风险增加，缺乏更为安全、有效的治疗手段[11]。因此，研究人员已聚焦于寻找具有促进睾酮分泌和维持骨量的天然化合物[12]。中医药多取材于天然化合物，研究发现二十五味鬼臼丸能通过促进骨形成、抑制骨吸收防治雌激素缺乏骨质疏松症[4-8]。睾丸切除诱导的骨质疏松症动物模型被广泛应用于男性骨质疏松研究[9]。为探究二十五味鬼臼丸对睾酮缺乏引起的骨质疏松症是否有防治效果，本研究通过双侧睾丸摘除构建睾酮缺乏所致的骨质疏松症大鼠模型。BPG、BALP是成熟且活跃的成骨细胞标志物，反映骨细胞的形成和活动状态[13-14]。OGP又称破骨细胞抑制因子，主要作用是增加骨强度、抑制骨吸收[15]。TRAP、β-CTX-Ⅰ因子表达水平能特异性反映破骨细胞的吸收活性[16-17]。血清Ca2＋是骨转换的常见指标，是辨别骨质疏松症的有效途径[18]。实验证明，模型组大鼠BGP、BALP、OPG、Ca2＋水平显著降低，TRAP、β-CTX-Ⅰ水平显著升高，二十五味鬼臼丸干预治疗后，可以调节血清中骨代谢指标趋于正常水平，反映二十五味鬼臼丸可降低破骨细胞活性，增加成骨细胞活性，与王申等[19]的中药提取物治疗睾酮缺乏骨质疏松症研究结果一致。研究证实，Wnt/β-catenin信号通路可能参与骨重建过程，影响峰值骨量，调控Wnt/β-catenin信号通路对于抑制骨质疏松症发展具有重要意义[20]。因此，对雄性动物骨质疏松症模型作用机制的研究逐渐聚焦于该信号通路。本研究发现，模型组大鼠 βcatenin和Runx2的mRNA和蛋白表达降低，二十五味鬼臼丸干预治疗后，Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达水平明显升高，结果提示激活该通路可能与防治去睾丸大鼠骨质疏松症有关。与阮立奇等[21]发布的研究结果相吻合。由于 β-catenin是Wnt信号通路中的关键调控因子，该通路本身的激活和抑制会受到多种因子调控。某些信号通路的激活可能通过β-catenin的翻译后修饰、蛋白聚集或核转运等方式，影响蛋白质的表达水平，从而出现mRNA与蛋白不一致的现象，需要在后期研究中深入探讨。综上所述，二十五味鬼臼丸能够调节成骨、破骨环路，从而防治睾丸切除诱发的大鼠骨质疏松症，为二十五味鬼臼丸防治男性骨质疏松症临床运用提供了实验依据。进一步研究表明，二十五味鬼臼丸改善去睾丸大鼠骨质疏松症作用机制可能与Wnt/βcatenin信号通路激活相关。

参考文献:

[4]李淑桢,王琦,李沁园,等.基于下丘脑-垂体-卵巢轴探讨藏药二十五味鬼臼丸对绝经后骨质疏松症大鼠的干预作用[J].中草药, 2021, 52(20): 6282-6290.

[5]王琦,李淑桢,代冬芳,等.二十五味鬼臼丸的植物雌激素样作用及其对雌激素受体的调控[J].中成药,2022, 44(1): 55-60.

[6]申继强,代冬芳,吴佩锋,等.藏药二十五味鬼臼丸通过OPG/RANKL/RANK通路对去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢的干预作用[J].中华中医药杂志, 2023, 38(11):5495-5499.

[7]余瑶,李沁园,代冬芳,等.藏药二十五味鬼臼丸对雌性去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢平衡的影响[J].中国高原医学与生物学杂志, 2023, 44(4): 236-242.

[8]江宇楠,张立雪,段方林,等.二十五味鬼臼丸激活PI3K/Akt/mTOR介导的自噬缓解去势大鼠骨质疏松作用[J].中国实验方剂学杂志, 2024, 30(22): 43-51.

[9]孙岩,陈冉,王小琦,等.建立雄性大鼠骨质疏松模型的方法学研究[J].中国骨质疏松杂志, 2017, 23(4):441-444.

[18]杨锋,孙玉华,刘佃滨,等.骨质疏松患者骨碱性磷酸酶､钙､磷代谢变化及与牙槽骨骨密度的相关性[J].中国骨质疏松杂志, 2017, 23(9): 1160-1166.

[19]王申,耿庆贺,还涵,等.冬凌草甲素对雄激素缺乏诱导的大鼠骨质疏松症的影响[J].江苏医药, 2020,46(3): 217-220.

基金资助:青海省科技厅项目(2023-ZJ-783);青海大学青年科研基金项目(2023-QYY-1);青海大学医学部中青年科研基金项目(2023-kyy);

文章来源:孙欣雨,杨爱萍,李凤辉,等.二十五味鬼臼丸对雄性骨质疏松症大鼠骨代谢影响及作用机制研究[J].现代药物与临床,2025,40(03):550-556.