骨质疏松（osteoporosis,OP）是一种全身性骨代谢疾病，主要表现为骨量丢失、骨组织退化和骨微结构发生改变，在绝经后女性与老年人中发病率较高[1,2]。而人口老龄化现象严重，中老年骨质疏松病人数量日益庞大[3]。目前市售抗OP药物种类较多，但存在一定的局限性和不良反应，病人骨代谢平衡等问题亟待解决[4]。中药复方结合了中医的整体观和辨证论治思想，并且毒副作用小，在骨质疏松的治疗上具有多靶点等优势[5]。

桃红四物汤包含桃仁、白芍等六味中药，是活血化瘀的经典方剂。研究发现，桃红四物汤可以通过改善血液流变学特征，促进间充质细胞归巢[6]等治疗OP[7]。因此，研究和揭示桃红四物汤对骨质疏松的干预作用与其机制，对此类活血化瘀类中药复方防治骨质疏松具有重大意义。

维甲酸诱导骨质疏松模型的建立相对简单，无须手术，而且具有较高的成功率[8]，且与骨质疏松病人临床症状、骨组织结构微观形态等方面较相似[9]。本研究2021年11月至2022年2月通过研究桃红四物汤对维甲酸诱导骨质疏松模型的骨量丢失、骨微结构退化、破骨细胞与成骨细胞分化的干预作用，为桃红四物汤治疗OP提供理论依据。

1、材料

1.1试剂与仪器

仙灵骨葆胶囊（批号2004033,0.5克/粒）购买自贵州同济堂制药有限公司，中性树胶（批号10004160），购自国药集团化学试剂有限公司。钙黄绿素（批号C7600）、维甲酸（批号A9120）、盐酸四环素（批号IT0130）购自北京索莱宝科技有限公司；BMP2抗体（批号18716101901）、番红固绿（骨组织）染液套装（批号G1053）、TRAP染液套装（批号G1050）、HE染液（批号G1005）购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

桃红四物汤6味药材中川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.，批号201201，四川）购于重庆万力有限公司；白芍（Paeonia lactiflora Pall，批号20200401，安徽）购于杭州振德中药饮片有限公司；熟地黄（Rehmanniae Radix Praeparata，批号210301，河南焦作）、当归（Angelica sinensis，批号210301，甘肃定西）购于亳州市京皖中药饮片厂；燀山桃仁[Purnus persica(L.)Batsch，批号210117，河北]购于江苏华洪药业科技有限公司；红花（Carthamus tinctorius L.，批号200810，新疆）购买于江苏同济中药饮片有限公司，经南京中医药大学邹立思老师鉴定为正品，均符合2015年版《中国药典》规定。

小动物Micro-CT影像系统（micro computed tomography,Sky Scan1176，德国Bruker公司）。钨钢刀、自动切片机、硬组织切片机（SP1600，德国Leica公司），组织包埋机（TEC2800，美国Thermo公司），正置光学显微镜（Eclipse E100，日本尼康公司），小动物麻醉机（Matrx VIP3000，美国MATRX公司），低温离心机（5417R，德国Eppendorf公司），酶标仪（Synergy H1，美国Bio Tek公司），分析天平（TB-214型，北京赛托利斯仪器有限公司）。

1.2动物

SPF级4月龄SD雌性大鼠40只，上海斯莱克实验动物有限责任公司。体质量（280±20)g。实验前1周自由饮食及进食，灯光控制昼夜各12 h，环境适应性培养。许可证号SCXK（沪）2017-0005。灌胃针灭菌后备用。

2、方法

2.1桃红四物汤水煎剂的制备

桃红四物汤水煎剂，组分配比为桃仁9 g，红花6 g，白芍9 g，当归9 g，川芎6 g，熟地黄12 g。酒当归制法为取当归净片适量，加黄酒拌匀，闷透，文火炒干；其余药味均依照2015年版《中国药典》方法炮制。桃仁去皮尖研泥，与红花、川芎、白芍、当归、熟地黄一同浸泡40 min，以10倍量体积水煎煮60 min，旋转蒸发浓缩成生药量为1.0 g/m L的溶液备用。前期HPLC检测发现桃红四物汤水煎液主要含有阿魏酸、苦杏仁苷、芍药苷、羟基红花黄色素A、绿原酸没食子酸、地黄苷A、梓醇8种特征性成分，与文献报道一致[10]。

2.2分组和给药

50只4月龄SD雌性大鼠随机分组：每组8只，分别为维甲酸模型组、正常对照组、桃红四物汤高剂量组（0.4 g/kg）、低剂量组（0.2 g/kg）、阳性药仙灵骨葆胶囊组（0.4 g/kg）。模型组给予维甲酸70 mg/kg；以蒸馏水为溶媒配制药液，仙灵骨葆胶囊质量浓度为0.04 g/m L，桃红四物汤质量浓度为0.02、0.04 g/m L。每天灌胃一次，连续给药30 d。骨组织双荧光标记步骤：实验终点第13天和第14天皮下注射四环素（30 mg/kg）、第3天和第4天皮下注射钙黄绿素（5 mg/kg）。操作在避光环境下进行。实验结束后，处死大鼠，剔除股骨表面肌肉和结缔组织，浸泡于福尔马林中，用于后续Micro-CT实验、组织形态观察及免疫组化分析。

2.3大鼠股骨Micro-CT扫描

大鼠右侧股骨固定清洗后进行Micro CT扫描成像。采用软件对静态参数骨密度BMD、骨小梁与骨组织面积比Tb.Ar、骨小梁宽度Tb.Th、骨小梁数量Tb.N、骨小梁分离度Tb.Sp进行测定。

2.4骨组织形态计量学参数的测定

大鼠处死后取股骨暴露骨髓腔后制成8µm厚切片，荧光显微镜下观察双荧光，测定动态参数：骨矿化表面积MS/BS、双荧光间平均距离Ir.L Wi、荧光周长L.Le、骨形成率BFR/BS、骨矿化沉积率MAR[11]。

2.5大鼠股骨H&E染色、番红固绿染色

各组大鼠股骨脱钙后切片，进行苏木素-伊红（HE）和番红固绿染色，进行脱水、透明、封片后，显微镜下观察。

2.6大鼠股骨TRAP染色观察破骨细胞

取大鼠股骨头冰冻切片回温自然晾干，-20℃甲醇固定10min后流水清洗，滴加适量的TRAP染色液覆盖标本，常温放置30 min后进行清洗、透明、封片。于显微镜下观察股骨组织中破骨细胞数量。

2.7大鼠股骨免疫组化分析BMP2表达

选取大鼠股骨组织，固定脱钙后进行包埋，切片脱蜡、抗原修复、非特异性封闭、免疫反应、DAB显色、苏木精复染后，于显微镜下观察并拍照，检测股骨中蛋白表达情况。

2.8统计学方法

所有实验数据结果以表示，统计分析应用SPASS 11.0统计学软件，独立样本t检验比较两组间数据，单因素方差分析比较多组间数据，LSD法应用于多组间数据两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1桃红四物汤对大鼠股骨松质骨骨小梁微结构的影响

Micro-CT观察大鼠股骨骨小梁微观结构，正常组松质骨紧密排列，骨小梁结构完整彼此连接，基本无镂空现象，形成织密的网络状连接；维甲酸模型组松质骨骨小梁比较疏散，孔隙较大，骨小梁数量也明显少于正常对照组，无规则排列，结构稀疏；阳性药组和桃红四物汤高剂量组（0.4 g/kg）骨小梁立体网状结构有所恢复，骨小梁数量明显增加（图1）。

3.2桃红四物汤对骨质疏松大鼠股骨松质骨计量学参数的影响

模型组大鼠股骨松质骨骨密度低于正常对照组，静态参数（Tb.Ar%、Tb.Th、Tb.N）亦小于对照组，说明维甲酸诱导大鼠骨量丢失严重，骨小梁密度降低；与正常组相比，Tb.Sp增加，以上均符合骨质疏松大鼠松质骨骨小梁分布特征。阳性药和桃红四物汤高剂量组（0.4 g/kg）骨密度显著提高（P<0.01),Tb.N、Tb.Th、Tb.Ar%均显著高于模型组（P<0.05),Tb.Sp明显低于模型组（P<0.05），和正常组接近（表1）。

与正常组相比，模型组荧光周长L.Le、骨矿化表面积MS/BS、双荧光间平均距离Ir.L Wi、骨矿化沉积率MAR、骨形成率BFR/BS均显著降低（P<0.01），提示维甲酸抑制了大鼠松质骨的骨形成，阳性药和桃红四物汤高剂量组（0.4 g/kg）显著提高了荧光周长、骨矿化表面积、双荧光间平均距离和骨矿化沉积率（P<0.05）（表2）。

正常组股骨松质骨荧光清晰，分布多，连续性较高，双荧光表现明显，四环素与钙黄绿素的间距较宽；模型组外侧钙黄绿素分布多，内侧四环素表现不明显，荧光强度明显减弱，分布弥散、模糊、黯淡；阳性药组和桃红四物汤高剂量组（0.4 g/kg）双荧光表现较强，四环素与钙黄绿素间距略宽于模型组；桃红四物汤低剂量（0.2 g/kg）组荧光分布较少，荧光间距较窄，内侧荧光不明显（图2）。

3.3桃红四物汤对骨质疏松大鼠股骨病理变化的影响

HE染色结果可见正常组骨小梁结构紧密、数量较多，排列均匀整齐，连续性好；模型组骨小梁结构被破坏，骨小梁较纤细、部分骨小梁不连续，有断裂和镂空现象、数目明显减少、骨小梁之间空隙增大；阳性药组和桃红四物汤低剂量组可见一小部分的断裂骨小梁和无骨小梁骨髓区；桃红四物汤高剂量组（0.4 g/kg）骨小梁面积有所增大，数量有所增加，结构紧密。番红固绿染色的结果和HE染色结果一致（图3）。

图1 Micro-CT观察桃红四物汤对大鼠股骨骨小梁微结构的影响：A为正常组；B为模型组；C为仙灵骨葆胶囊；D为桃红四物汤0.2 g/kg;E为桃红四物汤0.4 g/kg 

表1基于骨质疏松大鼠模型评价桃红四物汤对松质骨骨密度以及静态参数的影响 

表2基于骨质疏松大鼠模型考察桃红四物汤对松质骨动态学相关参数的调节作用 

3.4桃红四物汤对BMP2表达以及破骨细胞的调控作用

正常组可见骨小梁表面成骨细胞面积较大，与其他组相比，BMP2阳性表达最高，提示其成骨功能良好，破骨细胞表达水平较低；模型组骨小梁表面和骨边缘锁链状排列的成骨细胞明显较少，其中BMP2阳性的成骨细胞数量锐减，多细胞核的破骨细胞表达明显提高。阳性药组和桃红四物汤高、低剂量组骨小梁成骨细胞也呈梭状排列，BMP2阳性表达的成骨细胞比例明显升高，破骨细胞表达均低于模型组（图4）。

4、讨论

骨密度（bone mineral density,BMD）是骨骼强度的一个重要指标，对评价骨质疏松程度、骨折风险以及后续骨质疏松症的治疗非常重要[12]。骨组织形态计量学和骨微结构能从静态和动态两方面反映骨质疏松症的发展状况[13]，对此类代谢性疾病具有重大意义，有重要的应用价值。Micro-CT结果显示，维甲酸组大鼠股骨松质骨BMD、Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N降低，Tb.Sp增加，提示维甲酸造模后，大鼠股骨骨量流失，骨小梁网状结构被破坏，骨密度显著降低，骨的微观结构变差，5骨0折风险增加。双荧光能够直观地表现大鼠成骨细胞的功能状态，荧光间距反映矿化沉积率，与骨形成的速度有关[14]。维甲酸组L.Le、MS/BS、Ir.L Wi、MAR、BFR/BS均显著降低，提示成骨细胞功能受到抑制，骨形成速率降低，维甲酸抑制松质骨的骨形成，以上结果表明维甲酸诱导骨质疏松模型成功。与维甲酸组相比，桃红四物汤高剂量组大鼠股骨松质骨的BMD、Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N显著升高，Tb.Sp下降，骨量丢失的情况得到好转，提示桃红四物汤组大鼠松质骨骨量增加，骨的微结构得到改善。同时，骨形成的动态参数L.Le、MS/BS、Ir.L Wi、MAR、BFR/BS则明显增加（P<0.05），说明桃红四物汤能够促进骨的形成。

骨小梁结构是影响骨强度的关键因素，具有承载负荷等作用，骨小梁结构的病理变化能够反应骨小梁的生物性能，是评价骨质疏松症等疾病的重要指标[15,16]。HE和番红固绿染色结果显示其维甲酸组股骨骨髓腔变空，骨空泡增多，骨小梁断裂增多，排列顺序紊乱，提示维甲酸组骨组织微观结构发生改变。而桃红四物汤治疗后，大鼠骨小梁分离度减小，骨空泡数量减少，骨质疏松小鼠骨髓内容物增加，骨小梁数量增加。

成骨细胞减少以及破骨细胞异常增生导致两者比例失调是骨质疏松的重要诱因。病理学上特征性鉴定破骨细胞常用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）这一标志酶[17]，可以比较直观地反映出破骨细胞的分化程度，是评价骨质疏松的一个重要指标[18]。骨形态发生蛋白BMP对骨形成有重要调节作用，可以诱导成骨细胞分化，其中BMP-2能够促进骨形成，对于骨修复极其重要，有较强的成骨能力[19,20]。维甲酸组破骨细胞功能活跃数量增加，成骨细胞数量明显降低，骨吸收的速度与骨形成的速度无法动态失衡，导致骨质疏松的发生。与维甲酸组相比，桃红四物汤组TRAP的表达下降，BMP-2增多，表明桃红四物汤能够抑制破骨细胞的骨吸收活性，促进骨形成，改善骨吸收与骨形成的动态失衡，防治维甲酸诱导的大鼠骨质疏松。

研究发现，桃红四物汤在骨质疏松疾病治疗中效果显著。祝佳音等[7]发现地塞米松诱导的骨质疏松模型小鼠经过桃红四物汤治疗后，骨小梁数目与粗细程度均有改善、排列整齐、面积占比增加。杨国柱等[21]考察桃红四物汤对斑马鱼模型的作用，泼尼松可诱导骨质疏松，斑马鱼脊椎骨骼荧光强度经桃红四物汤治疗后明显提高。前期研究中，我们发现桃红四物汤（0.2、0.4 g/kg）对去卵巢模型的骨质疏松大鼠有缓解作用，在本研究中，同等剂量的桃红四物汤对维甲酸诱导的骨质疏松大鼠也有一定的治疗作用[22]。根据预实验的结果，本研究中阳性对照仙林骨葆胶囊的剂量设定为0.4 g/kg，与文献报道的有效剂量一致[23]，对维甲酸诱导的骨质疏松亦有一定的逆转作用。

综上所述，本研究通过维甲酸诱导骨质疏松大鼠模型，发现桃红四物汤能够减少骨量丢失，改善骨微结构退化，在一定程度上纠正骨吸收和骨形成的动态失衡，起到对骨质疏松的干预和改善作用，为发现中医经典名方新作用提供了新的参考依据。

图2大鼠股骨松质骨不脱钙未染色骨片荧光（×100):A为正常组；B为模型组；C为仙灵骨葆胶囊0.4 g/kg;D为桃红四物汤0.2 g/kg;E为桃红四物汤0.4 g/kg  

图3桃红四物汤对骨质疏松大鼠股骨病理变化的影响（×1.5)  

图4桃红四物汤对BMP2表达以及破骨细胞的影响(×200)

参考文献:

[2]郭萍,张廷,王俊红,等.阿司匹林联合阿仑膦酸钠在骨质疏松治疗中的有效性及对病人骨密度的影响[J].安傲医药,2020,24(10):2082-2086.

[3]赵晖,闫晓丽,王灿,等.覆盆子水煎液对维甲酸致小鼠骨质疏松模型影响[J].中药药理与临床,2019,35(2):92-96.

[5]张云飞,安军伟,龚幼波,等.原发性骨质疏松症的中医药防治研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2019,25(4):554-558.

[6]李汪洋,熊辉.桃红四物汤早期干预对大鼠骨折愈合中间充质干细胞归巢的影响[J].中国骨伤,2022,35(4):367-374.

[7]祝佳音,宿家铭,李焱鑫,等.桃红四物汤配方颗粒对糖皮质激素性骨质疏松小鼠模型的干预作用研究[J].辽宁中医杂志,2021,48(9);:203-206,后插6.

[8]区作明,刘效仿,李雪,等.骨宝丸对维甲酸诱导的骨质疏松小鼠OPG/RANKL通路的影响[J].中成药,2021.43(11)3158-3161.

[10]李双双,李双,杨建明,等.RP-HPLC法测定桃红四物汤提取物中9种水溶性活性成分的含量[J].中药新药与临床药理,2017,28(3):364-367.

[11]王芳,陈君,曾煦欣,等.黄芪散对糖皮质激素性骨质疏松大鼠股骨和胫骨的影响[J].中成药,2017,39(6):1109-1114.

[12]彭宜,琼仙,王威,等.骨密度的临床意义､检测方法及影响因素[J].当代医学,2021,27(27):191-194.

[13]李填,邓志博,李程程,等.骨关节炎与骨质疏松症的相互关系[J.中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志,2021,14(1):94-99.

[14]赵斌.维生素K2序贯唑来膦酸治疗骨质疏松症及其主要作用机制研究[D].济南:山东大学,2018.

[15]郜靓,梁丹妮,杨红霞,等.复方牦牛骨粉对骨质疏松大鼠的影响[J].中成药,2021,43(8):2035-2040.

基金资助:南京医学科技发展项目(QYK11148);

文章来源:张娴,徐志红,陈磊垚等.桃红四物汤对维甲酸诱导大鼠骨质疏松的干预作用[J].安徽医药,2023,27(08):1502-1506+1697.