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基于nirS型反硝化微生物群落结构的多样性进行海河口沉积物分析
摘要：以海河口典型淡水、淡海水以及海水环境的沉积物样品为研究对象,采用克隆文库及典范对应分析等方法研究了nirS型反硝化微生物群落结构的多样性。3个站位共获得154条有效序列,97%序列相似性水平划分为66个OTUs,海水环境的沉积物站位nirS型反硝化微生物多样性最高。系统进化分析显示,全部OTUs序列被划分为7个簇,最相近序列的微生物主要来源于河口、富营养化海湾、人工湿地及海水养殖沉积物等环境。海河口具有独特的反硝化微生物群落分布格局,典范对应分析结果表明该区域的盐度、有机碳以及氮相关营养盐水平是影响其群落特征的重要因素。
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海河是华北地区最大的入海河流,其河口位于渤海湾西北隅,属陆海双相河口,上有径流下泄,下有潮汐上溯[1]。河口地区是陆海相互作用的集中地带,各种过程(物理、化学、生物和地质)耦合多变,演变机制复杂,且极易受各种自然和人为活动的干扰,生态环境敏感脆弱。近年来随着开发海洋热潮的兴起和环渤海经济圈的高速发展,每年都有大量的生产、生活废水由海河口排入渤海湾,海河口生态环境受到较大破坏[2]。
河口生态系统中的微生物是维持体系生物活性的重要组分,对生物地球化学循环起着重要作用。微生物群落结构的变化能灵敏地反映或预示生态系统的改变[3]。就全球范围而言,输入河口的总氮约有50%通过反硝化作用被去除[4,5]。反硝化作用是反硝化微生物在厌氧环境下,利用硝酸根作为电子受体,将其还原为气体(NO,N2O和N2)的生物化学过程。反硝化细菌群落在海河口乃至渤海湾生态系统中发挥着极其重要的作用,其群落结构组成及多样性深刻反映着生态环境的变迁。因此河口反硝化微生物对环境的适应、改变及生态反馈研究尤为重要,目前河口区的反硝化微生物分析更多集中在珠江口、长江口、九龙江口及辽河口,海河口的相关研究较少[6,7,8,9]。
本研究选取海河口淡水、淡海水以及海水区典型的沉积物样品为研究对象,以nirS基因为分子标记,构建克隆文库,了解反硝化微生物菌群落结构的组成和多样性,并结合采样位点环境因子特征,探索海河口反硝化微生物群落与其生境相互关系。研究结果将有助于揭示反硝化微生物群落在河口生态系统中的分布及功能特性,以期为海河口的生态可持续发展提供依据。
1、材料与方法
1.1样品采集
本研究于2011年6月自海河-海河口-海岸带共设置3个采样位点(如图1)进行沉积物样品采集。其中H位于海河中下游,淡水为主,主要污染物主要来源于生活废水的排放;F位点为防潮闸,此处淡水与海水混合,常有船只停放,漏油时有发生;D位于渤海湾近塘沽海岸带,为大米草生态示范区,咸水为主,大米草作为抗盐、抗石油污染和保护海岸线的一种植物,它的存在使此位点的湿地特征比较明显。
利用底泥采集器采集沉积物样品,均匀混合后,立刻放入灭菌自封袋中,船上冰冻保存。返回实验室后,用于DNA提取的样品冻存在-80℃冰箱,用于环境数据分析的样品保存于4℃,样品均一式三份。
图1沉积物采样站位
1.2环境因子的测定
对沉积物样品的环境因子测定包括:沉积物中的氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、总氮、总有机碳、盐度、挥发性有机物和总石油类物质。沉积物用0.1mol/L的KCl浸提,振荡30min,过滤测得3种无机氮[10]。沉积物中的总有机碳(TOC)、总氮(TN)和盐度(S)按照LY/T1237、LY/T1228andLY/T1251国家标准分别进行测定。挥发性有机污染物(VOC)采用气相色谱-质谱法(GC-MS)测定[11]。总石油类物质采用红外测油仪测定[12]。采集样品的同时对样品所在地水体pH、溶解氧(DO)采用便携式水质分析仪(梅特勒,S975-uMixSevenExcellence)进行测定。
1.3克隆文库构建及分析
1.3.1宏基因组DNA提取
每个样品称取0.5g左右的沉积物,采用土壤DNA快速提取试剂盒进行3个平行样的基因组DNA提取。提取的DNA溶液用Nanodrop分光光度计测定浓度和质量,-80℃保存。
1.3.2克隆文库构建
使用nirS-1F(5’-CCTAYTGGCCGCCRCART-3’)和nirS-6R(5’-CGTTGAACTTRCCGGT-3’)为引物进行nirS基因扩增。PCR反应体系(终体积25μL)为100μMdNTP,1.5μMMgCl2,1×Taqbuffer,2μM引物,1.5UTaqDNA聚合酶,1μlDNA模板。反应程序参照Brian的操作[13],PCR产物通过1%的琼脂糖凝胶进行电泳检验。将纯化后的基因片段与pMD19-T载体(Takara,日本)连接,转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中进行蓝白斑筛选后,随机挑选阳性克隆送至北京六合华大基因有限公司进行测序,构建nirS基因克隆文库。
1.3.3nirS基因克隆文库分析
测序结果用Dotur软件剔除嵌合序列,97%序列相似性标准划分操作单元OTU,同时利用该软件计算文库覆盖率和Simpson(辛普森指数)、Shannon(香农威纳指数)多样性指数及ACE及Chao1丰富度指数[8]。
1.3.4构建nirS基因系统发育树
将测序成功的nirS基因序列提交到NCBI数据库中进行比对,选取相似性最高的序列作为构建系统进化树的参照序列。利用MEGA6.0软件,采用Neighbor-Joining方法构建系统发育树,进行系统发育分析。
1.3.5典范对应分析
反硝化微生物群落特性与环境因子的相关性采用CanocoforWindows4.5软件进行CCA分析。nirS文库中OTUs数据和环境因子经无量纲化后作为输入变量。
1.3.6nirS基因核酸序列登记号
nirS基因序列提交至NCBIGenBank数据库,序列号为KC106743-KC106897。
2、结果与讨论
2.1样品环境因子
3个位点采集样品的环境理化数据详见表1。其中挥发性有机物(VOC)检测结果中超出检测限的共有6种,分别为甲基叔丁基醚、三氯甲烷、四氯化碳、苯、甲苯和乙苯。样品中NO-2未检出,总有机碳与总氮比(C/N)在8.1～10.3之间,表明所研海域有机质主要来源于陆源污染[14]。石油、氨氮含量明显偏高,采样海域环境受石油开采、污水排放等人类活动的影响严重。D站位临近大米草生态示范区,由于植物残体及根部分泌的有机碳使得沉积物中有机碳含量显著增加。
表1采样站位的经纬度及理化性质
2.2nirS基因克隆文库的多样性
从构建的nirS基因克隆文库中随机挑选阳性克隆子进行测序,3个站位成功得到154条有效序列,用Dotur软件在97%的序列相似性水平上划分OTU,得到66个OTUs类型(见表2)。文库覆盖率为65.5%～82%,根据多样性指数Shannon和Simpson以及丰富度指数ACE和Chao1结果表明,3个采样站位中D克隆文库的多样性和丰富度最高,H站位次之。Francis等对切萨皮克湾5个采样点的nirS型反硝化细菌进行多样性分析发现,其多样性和群落结构都随盐度变化,即盐度较小的地点多样性较高,盐度含量相当的地点其群落物种组成相似[15]。Zheng等利用克隆文库,分析长江口潮间带沉积物中nirS型反硝化微生物群落也发现类似规律[7]。本研究结果中位于淡水环境的H位点多样性显著高于淡海水混合站位F,这与前面研究结果相一致,但是盐度最高的D站位多样性却是3个站位中最高的,推测这可能是由于采样站位受大米草生态区影响较大。有研究发现有机碳与硝酸盐供给充足可以大幅度促进反硝化过程[16,17],因此D站位的环境特点决定了反硝化微生物群落的多样性特征。
表2nirS基因克隆文库的生物多样性和丰富度指数
2.3系统发育分析
将核酸序列在NCBIGenBank数据库中进行比对,获得最相似序列,其相似度范围为82%～100%。GenBank中选取部分相似性最高的序列与所有OTUs类型随机序列一起构建系统进化树,如图2所示。
图2nirS序列系统进化树
nirS基因系统进化分析显示全部66个OTUs被划分为7个不同的簇(A—H)。淡水环境的H位点OTUs主要集中在ClusterB、C和F,相近序列主要来自于人工湿地和武汉东湖等盐度较低的环境。海水环境D位点OTUs主要出现在ClusterA、D和E,相近序列来自珠江河口、胶州湾以及近海对虾养殖区海域。而淡海水交界的F位点OTUs除在ClusterG较为集中与来自阿拉伯海溶氧较低区域及甘肃某温室土壤的nirS基因序列相近外,其它OTUs则相对比较分散。在ClusterH中,D、H两站位与来自长江口沉积物的nirS序列聚类在一起,同时与已知的反硝化模式微生物(Pseudomonasstutzeri)具有较近的亲缘关系[18]。来自相同环境特征的反硝化细菌功能序列同源性较高,表明海河口与珠江口、长江口、胶州湾等河口区或半封闭海域存在一定的生态环境相似性。本研究3个站位中淡水、海水环境样本聚类集中,而淡海水混合区nirS序列则较分散,推测盐度可能是导致这一聚类结果的关键因子,很多研究已经证实,盐度是影响微生物群落结构和多样性的主要因素之一[19]。
2.4典范对应分析
依据CanocoforWindows4.5软件用户指南,CCA中的单峰模型分析比线性模型更适合本实验数据结果。图3反映了海河口沉积物nirS型反硝化微生物群落组成、结构沿环境梯度变化的趋势。3个站位分别在不同排序轴内,表明其nirS型反硝化微生物群落由于环境因子的影响差异较大。总石油类物质是F位点的主要环境特征,与F位点相关性较大。D位点多样性最高,相关性分析结果表明,海河口区域盐度、有机碳以及氮相关营养盐水平可能是影响其分布格局的重要因素。
图3nirS型反硝化微生物OTUs与环境因子的CCA图
3、结论
(1)渤海湾海河口典型淡水、淡海水以及海水环境沉积物样品nirS基因克隆文库多样性指数显示,位于大米草生态区的盐度最高的样品中nirS型反硝化微生物多样性最高,其次为淡水环境样品,而淡海水混合区样品多样性最低。
(2)3个站位的OTUs序列经系统进化分析被划分为7个簇,其中淡水、海水环境站位聚类集中,淡海水混合区样品序列较分散,最相近序列的微生物主要来源于河口、富营养化海湾、人工湿地及海水养殖沉积物等环境。
(3)海河口具有独特的反硝化微生物群落分布格局,该区域的盐度、有机碳以及氮相关营养盐水平是影响其群落特征的重要因素。
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基金:国家自然科学基金重点项目(NSFC41731282).
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2020-05-27
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