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藁本内酯对高脂饮食小鼠骨骼肌功能及糖代谢因子干预效果

2024-11-12 55 上传者：管理员

摘要：目的探究藁本内酯对高脂饮食小鼠骨骼肌功能及糖代谢因子的干预效果及作用机制。方法将18月龄老龄小鼠随机分为空白、模型与药物干预组。处理后以游泳时间和拉力水平、便携式血糖仪、BS-240VET兽用生化检测仪分别测定小鼠肌肉力量、小鼠血糖及血清生化指标；试剂盒检测谷氨酰胺与糖原含量，以Western印迹检测小鼠骨骼肌中谷氨酰胺转运体(SLC1A)5与肌球蛋白(Myosin)的相对表达。进一步以小鼠骨骼肌细胞系C2C12为研究对象，马血清刺激分化后分成空白、模型及给药组。分别处理后显微镜观察细胞形态及细胞中脂滴的积累、细胞计数试剂(CCK)-8测定细胞活性、试剂盒测定细胞培养液中糖含量、流式细胞仪检测细胞周期；Western印迹检测细胞中的糖质合成酶激酶(GSK)-3β、真核翻译启动因子(elf)、糖原合酶(GS)、真核翻译延长因子(eEF)、p70核糖体蛋白S6激酶(p70s6k)及葡萄糖转运蛋白(GLUT)4表达与磷酸化(P)情况。结果与空白组比较，模型组GLU、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)表达显著上升，Myosin、p-elf、p-p70s6k水平显著下降，p-GSK-3p、p-eEF、eEF水平显著升高(P<0.05);与模型组比较，干预组游泳时间、拉力、糖原、谷氨酰胺、SLC1A5、Myosin水平、p-elf、elf、GS、p-p70s6k、GLU74显著上升，p-GSK-3β、p-eEF水平明显下降(P<0.05)。结论藁本内酯可以增强小鼠肌肉能力，改善小鼠与脂肪相关的血生化指标，提高骨骼肌中与功能相关因子和蛋白的表达，减轻脂肪在骨骼肌中的蓄积，促进细胞增殖，改善糖代谢。这些功能可能与藁本内酯对细胞糖脂代谢相关因子的调控有关。

关键词：
糖脂代谢紊乱
肌少症
藁本内酯
骨骼肌功能
高脂饮食
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肌少症是与增龄相关的一种渐进性和广泛性骨骼肌疾病，研究表明，在高脂饮食等因素的刺激下，肌间/肌内脂肪(IMAT)在骨骼肌内肌间的蓄积[1]可引起骨骼肌功能和糖脂代谢紊乱[2,3],导致胰岛素抵抗[4],引起肌量减少和肌肉生理功能减退[5],故减少IMAT蓄积，调节糖脂代谢因子紊乱可能对肌少症预防与治疗有积极影响。磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路参与骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取[6],诱导叉形头转录因子(FOXO)蛋白降解，肌肉蛋白水解减少[7],与胰岛素抵抗的发生密切相关，激活此通路及此通路下的调控因子可调节糖脂代谢及骨骼肌功能。

肌少症属于慢性病范畴[8],目前研究显示，全球60岁以上人群患病率超过10%[9],高于全年龄段人口患病率[10];在我国，60岁以上人群肌少症患病率达3%～31%[9],在老年群体中占相当比例。可以预见的是，随着我国人口老龄化加深，肌少症在总人群中的患病率将越发增高[11,12]。此外，肌少症还与多种代谢性疾病和器质性疾病密切相关[13]。故加强肌少症的预防对老年人群身心健康至关重要。目前治疗以运动、营养和药物治疗为主，但由于肌少症自身特点其一旦发生治疗效果欠佳。藁本内酯是伞形科中药材如当归、川芎中的活性成分之一[14],现代研究显示，其具有抗缺血[15]、抗炎[16]、神经保护[17]、保护血管内皮细胞[18]并促进血管新生[19]及抑制血管内脂质积累[20]的作用。本课题组前期研究发现，藁本内酯还可对抗骨骼肌缺血损伤、增强动物体力，展现出促进骨骼肌功能的潜力[21],但其是否具有改善高脂环境下骨骼肌糖脂代谢的能力尚不明确。本研究探讨藁本内酯对IMAT蓄积、骨骼肌功能及糖代谢因子水平的影响。

1、材料与方法

1.1实验动物

18月龄昆明小鼠，雄性，体质量30～35 g,购于成都达硕生物科技有限公司。

1.2实验细胞

C2C12小鼠成肌细胞购于广州吉妮欧生物科技有限公司。

1.3药物、试剂及仪器

藁本内酯(A0219,购于成都曼思特生物科技有限公司),高糖DMEM培养液(11965-092)、胎牛血清(16140-071,Gibco),细胞计数试剂(CCK)-8与二甲基亚砜(成都医学院科研中心提供),PI3K p85(17366)、Akt(9272)、p-Akt(4060)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)2(9698)及缺氧诱导因子(HIF)-1α一抗(36169,Cell Signaling Technology),血管内皮生长因子(VEGF)一抗(ab53465)、兔二抗(ab205718,Abcam),总蛋白定量测定试剂盒(A045-3-2,南京建成生物有限公司),谷氨酰胺试剂盒(K571-100,Biovision),糖原试剂盒(BC0345,Solarbio),糖原合成酶激酶(GSK)-3β蛋白一抗(#3187,Cell Signaling Technology),抗-GSK-3β(phosphor S9)蛋白一抗(20160515,Abcam)。96、12与6孔细胞培养板与培养皿(NEST),酶标仪(美国Biotek),高通量电泳槽、转印槽、凝胶成像仪(美国Bio-rad),全波长酶标仪(美国Biotek),二氧化碳孵箱微量匀浆仪、离心机、纯水仪(美国Thermo)。

1.4模型建立、分组及给药

1.4.1动物

小鼠饲养于23℃恒温空调房中，自由摄食与饮水。实验动物经1 w适应性饲养后进行干预与实验。将18月龄老龄小鼠随机分为空白、模型组、干预组，每组5只。空白组不进行任何造模处理；模型组在空白组的基础上，每日以高脂饲料进行饲养，持续8 w;干预组在模型组的基础上，于高脂饲料饲养1个月后，隔日按50 mg/kg皮下注射藁本内酯，持续4 w。

1.4.2细胞

细胞置于含5%CO2的37℃恒温孵箱中，使用10%胎牛血清的高糖培养液培养。每48 h换液一次，待细胞进入对数生长期后进行1∶3传代。取3～5代细胞进行实验。使用马血清刺激小鼠骨骼肌细胞系C2C12分化后，将细胞分为空白、模型与给药组。空白组以50μmol/L神经酰胺预处理8 h;模型组以50μmol/L神经酰胺预处理8 h,后以棕榈酸钠500μmol/L处理24 h;给药组在模型组的基础上，棕榈酸钠处理同时加入60μmol/L藁本内酯干预24 h。

1.5血糖及与脂肪相关的血生化指标检测

3组小鼠分别腹腔注射10%水合氯醛麻醉，迅速打开腹腔，使用输液针刺穿小鼠腹主动脉取血1 ml,置于肝素钠管中，静置10 min左右后3 000 r/min离心5 min,获得血浆，使用便携式血糖仪检测血糖(GLU),使用BS-240VET兽用生化检测仪检测血浆总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)与高密度脂蛋白(HDL)。

1.6小鼠肌力检测

负重游泳实验：取内壁光滑的塑料桶，其中加入(24±1)℃水至水深20 cm。准确称量小鼠体质量，将其体质量3%的铅块黏附于小鼠尾部中段后，置小鼠于水中。以小鼠停止游动10 s、或头部没入水中10 s以上为力竭标志，使用秒表记录小鼠从入水至力竭的时间，计算每组动物的平均游泳时间。拉力测试实验：取重量为100 g的砝码置于电子天平上，让小鼠将其前爪搭在砝码上。利用小鼠对抗非本意移动的天性，提住小鼠尾部垂直向上拉起，此时小鼠会用力提拉砝码，其提拉砝码的最大力量由电子天平记录。计算每组动物拉力的平均水平。

1.7骨骼肌中与功能相关因子的含量和蛋白表达的检测

取血后，使用组织剪小心剥去小鼠腿部皮肤，于肌腱处剪断、分离腓肠肌。将获得的腓肠肌组织剪碎，浸泡于液氮中，置于研钵中研磨破碎，再加入细胞裂解液2 ml,将组织糜转入玻璃匀浆器中进一步匀浆。将获得的匀浆液以13 000 r/min离心15 min,收集上清液，取500μl使用试剂盒检测各组小鼠骨骼肌中谷氨酰胺、糖原含量，取2μl使用Western印迹检测各组小鼠骨骼肌中谷氨酰胺转运体(SLC1A)5与肌球蛋白(Myosin)两种蛋白的浓度。

1.8油红染色观察细胞中脂滴的积累

按照试剂盒要求操作，将3组C2C12细胞进行油红染色后观察细胞中脂滴的积累。

1.9骨骼肌中与能量代谢相关蛋白表达的检测

倒出细胞培养液，用冷磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次后，加入细胞裂解液收集细胞，经离心后Western印迹检测3组细胞中的GSK-3β、真核翻译启动因子(elf)、糖原合酶(GS)、真核翻译延长因子(eEF)、p70核糖体蛋白S6激酶(p70s6k)及葡萄糖转运蛋白(GLUT)4表达情况。

1.10统计学分析

采用SPSS23.0软件进行方差分析，组间两两比较采用LSD法。

2、结果

2.1各组血糖与相关生化指标水平比较

与空白组相比，模型组GLU、TG、HDL和LDL表达显著上升(P<0.05);干预组以上指标均明显降低(P<0.05)。见表1。

2.2各组肌肉能力比较

模型组游泳时间较空白组有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05);干预组游泳时间相对于模型组明显上升(P<0.05)。模型组拉力较空白组有增强趋势，但差异无统计学意义(P>0.05);干预组拉力较模型组明显上升(P<0.05)。见表1。

2.3各组谷氨酰胺和糖原含量比较

模型组骨骼肌中的糖原与谷氨酰胺水平较空白组差异无统计学意义(P>0.05);干预组骨骼肌中的糖原与谷氨酰胺水平较模型组显著上升(P<0.05)。见表1。

表1 3组血糖、血脂生化指标、运动能力、骨骼肌糖原及谷氨酰胺比较

2.4各组骨骼肌运动相关蛋白表达水平比较

与空白组相比，模型组Myosin明显下降(P<0.05),SLC1A5则无明显变化(P>0.05);与模型组相比，干预组SLC1A5与Myosin水平显著上升(P<0.05)。见表2。

表2 3组骨骼肌SLC1A5与Myosin水平对比

2.5各组细胞中脂肪积累水平比较

油红染色结果显示，空白组细胞结构清晰、形态正常，几乎没有细胞有脂肪积累；模型组细胞形态变差、脂肪的积累明显增加；干预组细胞脂肪的积累明显减轻。见图1。

图1各组C2C12细胞中脂滴蓄积(油红染色，×200)

2.6各组骨骼肌中与能量代谢相关蛋白表达水平比较

与空白组相比，模型组细胞中磷酸化(p)-elf、p-p70s6k水平显著下降、p-GSK-3β、p-eEF、eEF水平明显上升(P<0.05);与模型组相比，干预组p-elf、elf、GS、p-p70s6k、GLU74显著上升，p-GSK-3β、p-eEf水平明显下降(P<0.05)。见表3。

表3各组C2C12细胞GSK-3β、elf、GS、eEF、p70s6k及GLUT4水平对比

3、讨论

肌少症对老年人危害大，会导致功能下降、跌倒、骨折、死亡等，以往研究中治疗肌少症的方法包括体力活动、营养疗法、雄激素疗法及其他行为和药理学方法[22],但肌少症一旦发生，往往治疗效果欠佳。因此，若在源头控制肌少症发生的病因，可能较之于之前单纯治疗有更好的效果。课题组前期研究发现，藁本内酯能够对抗骨骼肌缺血损伤、增强动物体力，展现出促进骨骼肌功能的潜力[21];本研究结果证实，藁本内酯确实可以在高脂衰老环境下增强动物骨骼肌功能。骨骼肌糖脂代谢的紊乱是IMAT出现的重要原因，其代表性事件胰岛素抵抗会导致骨骼肌对糖的利用能力下降。本研究结果说明，藁本内酯对骨骼肌功能的促进可能与调控能量代谢有关。

PI3K-Akt信号通路胰岛素抵抗相关的一条信号通路，它参与增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种活动[23],脂肪蓄积导致胰岛素抵抗可能与脂质抑制了PI3K-Akt这一重要信号通路有关[24]。在既往明确藁本内酯对该通路激活的基础上，本研究直接考察了PI3K-Akt通路下游效应因子的变化情况。

PI3K/Akt/GSK3为胰岛素信号传导的主要通路，在血糖调控方面发挥关键作用[25]。GSK-3β是调节骨骼肌GS活性、肌糖原合成及胰岛素应答的关键酶[26,27];GS是调控糖原合成的限速酶，GS表达量降低提示胰岛素传递障碍[28];elf2B是elfs家族中的重要成员，通常以结合二磷酸鸟苷elf2B无活性状态存在[29]。GSK-3β活性降低，会引起GS和elf2B去磷酸化，最终导致糖原和蛋白合成激活，血糖降低；反之，GSK-3β活性增加，GS和elf2B活性被抑制，血糖上升[30]。本研究证明，藁本内酯可以激活PI3K-Akt通路，调节高脂环境下的细胞能量代谢。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种在进化过程中高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[31];p70s6k是mTOR下游的关键蛋白，mTOR/p70s6k信号通路可调节葡萄糖代谢和胰岛素敏感性，参与IR[32];eEF2B主要调控蛋白质的翻译，其磷酸化会导致骨骼肌细胞合成蛋白质能力紊乱[33];GLUT4是胰岛素敏感的靶组织主要的胞膜转运蛋白，而脂肪细胞和骨骼肌细胞内胰岛素信号通路受损会导致GLUT4转位障碍[34]。本研究结果证明，藁本内酯可以激活PI3K-Akt通路，调节骨骼肌蛋白合成，改善糖代谢。

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