马方综合征(MFS)是由原纤维蛋白1(FBN1)基因突变引起的一种常染色体显性遗传病,主要表现是形成超过正常血管直径1.5倍的胸主动脉瘤,胸主动脉瘤破裂是MFS患者的主要死因[1-2]｡除了主动脉瘤以外,MFS的另一个主要表现是骨骼肌质量的下降,即肌少症,而且发病时间早于主动脉瘤｡肌少症或肌萎缩会进一步加剧主动脉瘤的进程,并影响MFS患者手术治疗的预后[3]｡研究表明MFS患者和MFS模型小鼠FBN1C1039G/+转基因(FBN1TG)小鼠的主动脉组织中均存在线粒体功能下降的现象,线粒体功能下降的主要原因是FBN1突变后导致细胞外基质的稳态失调,抑制了线粒体的合成[2]｡烟酰胺腺嘌呤二核苷酸前体烟酰胺核糖(NR)是维生素B3衍生物,补充NR可促进血管平滑肌细胞中的线粒体合成提高线粒体功能,逆转MFS模型小鼠的主动脉瘤表型｡骨骼肌也是一种富含细胞外基质和线粒体的组织,在骨骼肌损伤再生的过程中,肌纤维中线粒体含量和功能的下降也会引起骨骼肌萎缩和肌少症[4-5]｡目前补充NR是否可以改善MFS的肌少症表型尚不完全清楚｡本研究旨在MFS模型小鼠中观察补充NR对肌纤维形成过程中线粒体合成和MFS小鼠肌少症的影响｡

1、材料与方法

1.1实验动物FBN1TG小鼠[动物合格证号:SCXK(苏)2022-0061]购买于赛业生物科技有限公司,并于首都医科大学附属北京安贞医院实验动物中心进行饲养和繁殖,恒温(22±2)℃,12h/d光照,自由摄食饮水｡选取3月龄的TG小鼠和同笼对照的野生型小鼠进行实验｡所有实验过程遵循国家实验动物管理的相关法律和规定,并经首都医科大学附属北京安贞医院实验动物福利与伦理委员会批准实施(AZ2024LA020)｡

1.2主要试剂与仪器心脏毒素(德国Sigma公司)､NR(美国MedChemExpress公司,批号:HY-123033A)､线粒体染料Mito-Tracker(美国ThermoScientific公司)､肌球蛋白重链(MyHC)抗体(美国Abcam公司)､从ATCC(CRL-1772)获得小鼠成肌细胞C2C12细胞､杜氏改良Eagle培养基(DMEM培养基)､Leica激光共聚焦显微镜(TCS4D);异硫氰酸荧光素偶联的小麦胚芽凝集素(WGA,1∶200稀释,德国Sigma公司)､NIS-ElementsBr3.0软件(ECLIPSE90i,日本Nikon公司)､NanodropND-2000C测量仪(美国ThermoScientific公司)､GoScript反转录试剂盒(美国Promega公司)､2×SYBR混合液(日本Takara公司)和Bio-RadCFXConnect系统(美国Bio-Rad公司)｡

1.3方法

1.3.1骨骼肌再生模型的建立及干预方法10只3月龄的雄性野生型和10只FBN1TG小鼠使用1%戊巴比妥钠(100mg/kg)腹腔注射麻醉后,使用注射器将10μmol/L心脏毒素30μl对胫骨前肌进行肌内注射制备骨骼肌损伤模型｡于损伤后第10天收取野生型和FBN1TG小鼠各6只的双侧胫骨前肌,左侧固定后用于透射电镜观测线粒体数量,右侧直接冻在液氮中用于后续提取组织RNA｡于术后第15天收取2组各4只小鼠的胫骨前肌用于检测新生肌纤维面积｡另将8只FBN1TG小鼠完全随机分为2组,分别于术后第3､5､7天腹腔注射NR溶液1000mg/kg或等体积0.9%氯化钠注射液,于术后15d收取胫骨前肌用于检测新生肌纤维面积｡

1.3.2小鼠骨骼肌组织WGA染色小鼠胫骨前肌经脱水处理后,垂直包埋成蜡块,制成5μm厚度的石蜡切片｡切片脱蜡至水后,使用10mmol/L柠檬酸钠缓冲液(pH值6.0)抗原修复后用羊血清封闭30min,将WGA抗体(1∶200)稀释后加在切片上,置于37℃避光孵育1h后,洗去抗体,滴加4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)封片剂染细胞核封片｡使用荧光显微镜采集图像,使用NISBr3.0图像分析软件统计肌纤维横截面面积,每个骨骼肌组织统计200~300个肌纤维｡

1.3.3C2C12肌卫星干细胞的培养和诱导分化使用生长培养基(含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基)培养C2C12肌母细胞系,待细胞密度达到80%左右进行传代培养｡当诱导分化时,待细胞密度达到90%以上,将培养基更换为分化培养基(含2%马血清和1%双抗的DMEM培养基),同时分别加入终浓度为0.5mmol/L的NR(NR组)和等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)处理细胞(对照组),至少每2天更换1次培养基｡诱导分化3d后,提取细胞mRNA用于实时聚合酶链反应检测分化相关基因表达,或固定后进行免疫荧光染色｡

1.3.4C2C12细胞中的线粒体含量诱导C2C12细胞分化3~5d,用线粒体染料Mito-Tracker(1∶1000)溶于无血清DMEM培养基对活细胞进行避光染色30min,换成普通无血清DMEM培养基,通过荧光显微镜观察｡

1.3.5胚胎肌球蛋白重链(eMyHC)染色观察肌纤维融合情况在室温下将诱导分化C2C12肌母细胞在4%甲醛中固定15min,用含0.3%TritonX-100的PBS进行透化,然后用含有5%牛血清白蛋白的PBS室温下封闭1h｡然后将细胞与MyHC一抗(1∶100稀释)在4℃下孵育过夜｡用含有0.1%TritonX-100的PBS洗涤3次后,将细胞与偶联AlexaFluor555(1∶500)的羊抗小鼠荧光二抗在37℃下孵育1h｡最后,用PBS进行清洗,尽可能吸走液体后使用DAPI封片剂封片,共聚焦显微镜拍摄肌管｡

1.3.6mRNA提取胫骨前肌和细胞使用TRIzol法提取总RNA后,使用Nanodrop2000测量样本浓度｡根据GoScript逆转录试剂盒说明书的步骤将2μg的各样本RNA反转录为cDNA｡将cDNA､SYBRGreenⅡ酶､缓冲液等按照实时聚合酶链反应试剂盒说明书混匀后,使用Bio-RADCFXConnect®聚合酶链反应仪进行扩增,扩增条件如下:90℃3min,60℃15s,72℃30s,40个循环｡以甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为mRNA的内参｡基因的表达水平以得到的相应的Ct值用2-ΔΔCt法进行计算｡聚合酶链反应引物序列如下,线粒体编码的细胞色素c氧化酶Ⅰ正向序列:5'-GCTCTGGTCCGGTCTTTTAGC-3',反向序列:5'-GTACTGGGAGGTCATTGTCGG-3';线粒体编码的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶1正向序列:5'-TCACTATTCGGAGCTTTACGAGC-3',反向序列:5'-CATATTATGGCTATGGGTCAGGC-3';泛醇-细胞色素c还原酶核心蛋白1正向序列:5'-TCACTATTCGGAGCTTTACGAGC-3',反向序列:5'-CATATTATGGCTATGGGTCAGGC-3';过氧化物酶体增殖物激活受体γ正向序列:5'-GGAAGACCACTCGCATTCCTT-3',反向序列:5'-GTAATCAGCAACCATTGGGTCA-3';含富亮氨酸的三角五肽重复序列正向序列:5'-AACGAAAGACCTTCCGATCAC-3',反向序列:5'-CGGCCTGTTTCATCACTGTG-3';丙酰辅酶A羧化酶亚基α正向序列:5'-GGTTTTAGGGGATAAACATGGCA-3',反向序列:5'-CCATTGCTTGGCGAGTTTCA-3';肌细胞生成素正向序列:5'-CTGTTTAAGACTCACCCTGAGAC-3',反向序列:5'-GGTGCAACCATGCTTCTTCA-3';甘油醛-3-磷酸脱氢酶正向序列:5'-AGCTTCGGCACATATTTCATCTG-3',反向序列:5'-CGTTCACTCCCATGACAAACA-3'｡

1.4统计学方法采用SPSS22.0统计软件分析数据｡计量资料以xs表示,符合正态分布者组间比较采用非配对t检验,非正态分布者组间比较采用非参数检验｡P<0.05为差异有统计学意义｡

2、结果

2.1骨骼肌组织FBN1TG小鼠的腓肠肌质量/肌肉长度比值与胫骨前肌质量/肌肉长度比值均低于野生型小鼠[(0.0480±0.0040)g/cm比(0.0550±0.0009)g/cm､(0.0180±0.0002)g/cm比(0.0190±0.0002)g/cm](t=3.521､9.438,均P<0.001)｡造模前,FBN1TG小鼠骨骼肌肌纤维的横截面面积小于野生型小鼠[(395±8)μm2比(533±11)μm2](t=3.521,P<0.001),表现为肌少症｡术后第15天,FBN1TG小鼠骨骼肌中新生肌纤维横截面面积依然小于野生型小鼠[(577±63)μm2比(888±113)μm2](t=4.157,P<0.001)｡见图1｡

图1原纤维蛋白1C1039G/+转基因及野生型小鼠骨骼肌肌纤维横截面面积观察(小麦胚芽凝集素免疫荧光染色)

2.2新生骨骼肌中线粒体数量及相关基因表达术后第10天,FBN1TG小鼠骨骼肌肌纤维中线粒体数量少于野生型小鼠[(7.4±1.6)%比(11.3±2.9)%](t=2.615,P<0.001)｡见图2｡线粒体相关基因检测结果显示,术后第10天FBN1TG小鼠骨骼肌中线粒体复合体Ⅰ关键基因线粒体编码的细胞色素c氧化酶Ⅰ､线粒体编码的NADH脱氢酶1､复合体Ⅲ关键基因泛醇-细胞色素c还原酶核心蛋白1､脂肪酸β-氧化关键基因丙酰辅酶A羧化酶亚基α､线粒体功能基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ和含富亮氨酸的三角五肽重复序列的表达均低于野生型小鼠[(0.68±0.07)比(1.26±0.40)､(0.67±0.17)比(0.99±0.11)､(0.65±0.19)比(1.02±0.22)､(0.54±0.14)比(1.09±0.22)､(0.66±0.06)比(0.94±0.21)､(0.64±0.12)比(0.86±0.10)](t=2.906､3.890､3.211､5.140､3.150､3.127,均P<0.001)｡

图2透射电镜观察野生型和原纤维蛋白1C1039G/+转基因小鼠胫骨前肌新生骨骼肌中线粒体数量变化

2.3NR对肌母细胞的作用NR组C2C12肌母细胞中分化相关基因肌细胞生成素的表达高于对照组[(1.9±0.3)比(1.0±0.3)](t=4.460,P<0.001)｡eMyHC免疫荧光染色结果显示,NR组融合形成的肌纤维的阳性面积大于对照组[(10.1±1.4)%比(4.9±1.4)%](t=5.753,P<0.001)｡Mito-tracker染色结果显示,NR组细胞中线粒体含量高于对照组[(37.8±3.1)%比(19.8±2.1)%](t=13.140,P<0.001)｡见图3｡

图3烟酰胺核糖对C2C12细胞中线粒体生成和肌纤维融合形成的影响

2.4NR对FBN1TG小鼠新生肌纤维的影响术后第15天,NR处理的FBN1TG小鼠的骨骼肌肌纤维横截面面积大于0.9%氯化钠注射液处理的FBN1TG小鼠[(836±52)μm2比(550±36)μm2](t=9.017,P<0.001)｡见图4｡

图4烟酰胺核糖对原纤维蛋白1C1039G/+转基因小鼠新生肌纤维的作用(小麦胚芽凝集素免疫荧光染色)

3、讨论

MFS患者除主动脉瘤的主要表型以外,另一个特点是四肢细长,全身骨骼肌发育不良,并随年龄增长萎缩程度加重,严重影响日常运动能力[6]｡本研究发现FBN1C1039G/+转基因小鼠在3月龄时即发生骨骼肌质量下降,肌纤维横截面面积变小的表型,即发生肌少症｡骨骼肌的正常功能以肌纤维蛋白合成与分解的动态平衡为基础,肌细胞蛋白过度降解是导致肌肉减少的原因之一｡另外,骨骼肌肌纤维损伤再生稳态的失衡是导致肌肉体积下降的另一原因｡正常骨骼肌处于损伤和再生修复的平衡状态,有效的骨骼肌再生有助于维持肌肉质量｡骨骼肌的再生主要依赖位于基底膜的肌卫星干细胞的功能｡肌卫星干细胞被激活为肌母细胞后,增殖分化并融合成新的肌纤维｡同时蛋白质的合成促进肌纤维横截面面积的增大｡当肌母细胞形成肌纤维的能力受损时会导致新生骨骼肌的体积变小[7-8]｡

本研究结果显示FBN1TG小鼠损伤后新生的肌纤维面积仍然小于野生型小鼠,表明该小鼠肌少症的发生与蛋白质消耗增加无关,主要在于纤维蛋白的合成和肌卫星干细胞的增殖分化能力的改变方面｡既往研究显示FBN1TG小鼠的主动脉组织中由于FBN1突变后导致细胞外基质的稳态失调,抑制了线粒体的合成,从而导致线粒体功能下降[2]｡骨骼肌富含线粒体,线粒体是骨骼肌代谢功能及其应答生理或病理反应的关键｡骨骼肌中的线粒体主要作用包括:通过氧化磷酸化产生ATP,为肌肉收缩和细胞内的生物合成提供能量;线粒体是细胞内主要的活性氧产生和清除的场所,并维持氧化还原系统的平衡[9-10]｡当线粒体功能失调时,肌细胞内氧化应激压力增多可进一步诱导下游核因子κB通路以及叉头框O通路的活化,进而导致肌细胞自噬以及蛋白降解增多,促进肌少症的发生[11-12]｡本研究结果显示FBN1TG小鼠的骨骼肌损伤后新生的肌纤维中线粒体数量减少,线粒体功能相关基因的表达显著下调｡这与上述研究发现该转基因小鼠血管平滑肌细胞中的线粒体数量减少一致｡

NR是一种维生素B3的衍生物,因其强大的抗氧化作用而备受关注｡多项研究证明使用NAD+前体NR已成为促进不同疾病病理改变中线粒体功能障碍的有效方法[13-16]｡例如在一种Sco2基因缺失导致的线粒体病的动物模型中,给予NR治疗可以显著增加线粒体功能关键基因的表达量和线粒体复合物的活性,并提高运动耐力[17]｡而且MFS小鼠给予NR治疗1个月可明显抑制主动脉的扩张程度[2]｡本研究中,体外实验结果显示NR处理可增加肌卫星干细胞中线粒体数量,促进其更快的分化融合形成新的肌纤维｡同时体内实验表明补充NR可以显著增加FBN1TG小鼠损伤后形成肌纤维的横截面面积,这些结果提示NR可用于MFS肌少症的治疗｡而且既往研究表明,NR具有良好的安全性和有效性,其可口服,且具有良好的生物利用度,长期口服补充NR可有效地刺激NAD+代谢,健康成人包括中老年人都能够良好地耐受[18-19]｡因此本研究进一步证明了NR可能成为临床MFS治疗新的辅助用药,用于改善肌少症的表型｡但本研究未能通过肌力和耐力实验等评价NR补充对FBN1TG小鼠的运动能力的影响,可以在未来的研究中进一步探索｡

综上所述,补充NR可促进线粒体合成和肌纤维的形成,从而改善MFS小鼠肌少症的表型｡且由于NR可口服吸收利用,具有良好的生物利用度,为MFS治疗肌少症改善运动能力提供了新的治疗方案｡

基金资助:国家自然科学基金(82272477)~~;

文章来源:洪诗瑶,张燕红,姚可欣,等.烟酰胺核糖改善马方综合征小鼠肌少症的作用研究[J].中国医药,2025,20(05):673-677.