首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 肿瘤科论文 > 结直肠癌论文 > 长链非编码RNA SNHG1对结直肠癌增殖、迁移影响及调控机制

长链非编码RNA SNHG1对结直肠癌增殖、迁移影响及调控机制

2024-03-06 17 上传者：管理员

摘要：目的：探讨长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因1 (SNHG1)对结直肠癌（CRC）增殖、迁移的影响及其调控机制。方法：采用实时荧光定量PCR检测人正常结直肠上皮细胞（FHC）、结直肠腺癌细胞系（HT29）细胞中IncRNA SNHG1的表达水平。将HT29细胞分为干扰组（si-SNHG1）和对照组（si-NC），分别转染SNHG1 siRNA和NC siRNA，采用MTT检测细胞增殖活力，Transwell实验检测细胞迁移能力，Western blot检测JAK-STAT信号通路相关蛋白表达。结果：HT29细胞中SNHG1的表达明显高于FHC细胞，差异有统计学意义（t=17.045,P<0.05）;si-SNHGI组细胞增值活性、迁移细胞数均降低，差异有统计学意义（t=16.317、12.714,P<0.05）,STAT3蛋白表达差异无统计学意义（t=1.063,P>0.05）,P-STAT3蛋白表达减少（t=15.473,P<0.05）。结论：SNHG1在CRC细胞中呈高表达，可促进CRC细胞增殖、迁移，其机制可能与SNHG1上调P-STAT3蛋白的表达促进JAK-STAT信号通路活化有关。

关键词：
增殖
小核仁RNA宿主基因1
结直肠癌
迁移
长链非编码RNA
加入收藏

结直肠癌（CRC）是常见的消化系统恶性肿瘤，近年来，其发病率和死亡率呈快速增长趋势[1,2]。尽管CRC诊疗技术不断改进，但CRC的死亡率仍然较高，主要原因与CRC早诊率低、转移复发率较高、敏感性分子靶向药物较少等因素有关，因此，探索CRC新的诊断标志物，发现其增殖、迁移相关分子靶标对于CRC临床诊断、治疗尤为重要。长链非编码RNA(lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸的转录本，不能翻译蛋白质，其在表观遗传、转录及转录后水平通过对靶基因调控参与众多病理生理过程[3]。研究表明，lncRNA与CRC增殖、侵袭、迁移等生物学过程密切相关[4]。小核仁RNA宿主基因1(SNHG1）是位于染色体11q12.3的新型lncRNA，其在神经母细胞瘤、肺癌、骨肉瘤等恶性肿瘤的发生发展中发挥着重要的调控作用[5]。SNHG1在CRC中的生物学功能及调控机制，目前研究报道较少，本研究旨在探讨SNHG1对CRC增殖、迁移的影响及潜在的调控机制，以期为CRC潜在肿瘤标志物及药物治疗靶标的发现提供新的理论依据。现将研究结果报告如下。

1、材料与方法

1.1 细胞系、主要试剂和仪器

人正常结直肠上皮细胞系FHC、结直肠癌细胞系HT29均购自中科院上海细胞库。DMEM培养基、胎牛血清购自江苏齐氏生物科技有限公司。胰蛋白酶购自厦门海标科技有限公司。青霉素、链霉素购自上海择叶生物科技有限公司。磷酸盐缓冲液PBS购自广州威佳科技有限公司。蛋白裂解液购自上海康朗生物科技有限公司。qPCR试剂盒购自江苏天净沙基因诊断技术有限公司。引物、SNHG1小干扰RNA序列，阴性对照序列均由上海康颜生物科技有限公司设计合成。脂质体liPofectamine2000购自北京沃比森科技有限公司。四甲基偶氮唑盐（MTT）试剂盒购自上海联迈生物工程有限公司。STAT3、P-STAT3抗体购自上海钦城生物科技有限公司。超净工作台购自济南腾昊科学仪器有限公司。细胞培养箱购自上海合恒仪器设备有限公司。SH2-16K离心机购自深圳三莉科技有限公司。164-5050电泳仪购自济南爱来宝仪器设备有限公司。倒置显微镜购自上海工洲阀门有限公司。Transwell小室购自北京优尼康科技有限公司。Tanon2500凝胶成像仪购自上海橙诚科学仪器有限公司。

1.2 细胞培养、转染和分组

将复苏后的FHC、HT29细胞接种于含1%青霉素-链霉素双抗、10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，置于37℃、5%CO2培养箱中进行常规培养。48 h后倒置显微镜下观察细胞生长情况，弃去培养液、PBS清洗3遍，加入0.5 mL事先配置好的胰蛋白酶消化液充分消化。当细胞消化至变圆时弃去消化液终止消化，加入5 mL DMEM培养液反复吹打，使细胞呈单细胞悬液状态，1 200 r/min离心5 min，弃上清，收集HT29细胞，加入MEM培养液，调整细胞密度至4×104个/mL，吸取3 mL HT29细胞悬液于6孔板中，置于细胞培养箱中培养，待细胞生长汇合度达到70%～80%时进行细胞转染操作。按照liPofectamine 2000转染试剂说明书分别将SNHG1小干扰RNA序列（si-SNHG1）、阴性对照序列（si-NC）转入HT29细胞，并将其设置为si-SNHG1组和si-NC组。

1.3 qRT-PCR

胰酶消化并收集各组处于对数期生长的细胞于6孔板中，每孔加入150μL Trizol试剂，反复吹打细胞，移入无Rnase的EP管中，加入250μL氯仿，振荡混匀后12 000 r/min离心10 min，小心吸去上层液于另一个无RNase的EP管中，加入等体积异丙醇充分混匀，用同样方法离心，弃去上清，加入1 mL 75%乙醇，7 500 r/min离心5 min，弃上清，置于冰上晾干，采用分光光度计测量RNA浓度。取1μgRNA为模板逆转录为cDNA，采用qPCR试剂盒检测SNHG1 mRNA表达水平，以GAPDH为内参，采用2-△△CT法计算SNHG1相对表达量。

引物序列：SNHG1上游5'-CCTAAAGCCAC⁃GCTTCTTG-3'，下游5'-TGCAGGCTGGAGATCCTACT-3'。GAPDH上游5'-TGTAGGCTCATTTGCAGGGG-3'，下游5'-ATGGCATGGACTGTGGTCTG-3'。

1.4 MTT

将si-SNHG1组和si-NC组细胞以每孔2×103个细胞密度接种于96孔板，每组设置3个复孔，置于37℃培养箱中培养。培养24 h、48 h、72 h，每孔加入20μL MTT试剂，培养箱中避光孵育3 h，弃去培养液，并加入100μLDMSO试剂，充分振荡，酶标仪检测各孔490 nm处光密度（OD）值，OD值大小表示细胞增殖活性强弱。

1.5 Transwell

胰酶消化并收集处于对数期生长的si-SNHG1组和si-NC组细胞。采用不含胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞，将细胞密度调整为2×105/mL，将Transwell小室置于24孔板中，取100μL上述细胞悬液加入Transwell上室，Transwell下室加入600μL含10%胎牛血清的DMEM培养液，37℃培养箱中培养24 h，甲醇固定10 min，结晶紫染色15 min，无菌棉签擦去未穿膜的HT29细胞，显微镜观察并随机取6个视野并计算迁移细胞个数。

1.6 Western blot

分别收集处于对数期生长的si-SNHG1组和si-NC组细胞于离心管中，加入RIPA裂解液，置于冰上裂解10 min，离心取上清液，采用BCA法测定蛋白质浓度。根据说明书配置SDS-PAGE胶，每孔上样量为25μg蛋白质，进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后，将蛋白质转移至PVDF膜上，室温下5%的脱脂牛奶封闭2 h。加入一抗（STAT3、P-STAT3稀释浓度均为1∶1 000),4℃下孵育过夜，TBST充分洗膜后，使用辣根酶二抗标记物室温下孵育2 h。采用化学荧光发光法（ECL）显影，以GAPDH为内参，Image J软件分析目的蛋白和内参光密度值，将目的蛋白与内参GAPDH光密度比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.7 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 SNHG1在CRC细胞系HT29、结直肠上皮细胞FHC中的表达

qRT-PCR检测CRC细胞系HT29、结直肠上皮细胞FHC中SNHG1的表达水平，HT29、FHC细胞中SNHG1的相对表达量分别是（4.26±0.15）、（1.06±0.08），与FHC细胞相比，HT29中SNHG1的表达水平显著升高，差异有统计学意义（t=17.045,P=0.000）。

2.2 干扰SNHG1表达对HT29细胞增殖、迁移的影响

si-SNHG1组、si-NC组HT29细胞中SNHG1表达分别是（1.21±0.07）、（4.15±0.32),si-SNHG1组显著低于si-NC组（t=16.317,P=0.000）。MTT实验结果显示，si-SNHG1组HT29细胞在培养24h的OD值与si-NC组，差异无统计学意义（t=2.014,P=0.079），但在48 h、72 h的OD值显著低于si-NC组，差异有统计学意义（t=5.173,P=0.006;t=8.426,P=0.002）。Transwell迁移实验结果显示，si-SNHG1组HT29细胞迁移数明显低于si-NC组，差异有统计学意义（t=12.714,P=0.001），见表1。

2.3 干扰SNHG1表达对JAK-STAT信号通路相关蛋白表达的影响

Western blot检测si-SNHG1组、si-NC组HT29细胞中STAT3、P-STAT3的表达，其表达量分别为（0.73±0.09）、（0.71±0.15);(0.23±0.06）、（0.68±0.14),STAT3在si-SNHG1组和si-NC组中的表达，差异无统计学意义（t=1.063,P=0.084），与si-NC相比，P-STAT3在si-SNHG1组中的表达明显降低，差异有统计学意义（t=15.473,P=0.000）。

表1 干扰SNHG1表达对HT29细胞增殖、迁移的影响（±s)

3、讨论

CRC是我国常见的消化道恶性肿瘤，CRC早期症状隐匿，缺乏特异性、敏感性较高的诊断标志物，大多数发现时已处于中晚期并伴有局部浸润和转移，导致CRC患者总体生存率较低。CRC发病机制较为复杂，至今尚未完全阐释，其涉及体内外多种因素，包括饮食习惯、生活方式的变化；吸烟饮酒等不良生活习惯；遗传和表观遗传学的改变等。因此，深入探索CRC发生发展的分子机制，对于CRC特异性标志物的发现，CRC新型分子靶点药物的开发具有重要的临床应用价值。lncRNA是一类长度超过200个核苷酸，无编码蛋白功能的转录本，在肿瘤发生、增殖、迁移等生物学过程中发挥着重要的调控作用。已有研究表明，多种不同类型的lncRNA参与CRC进展，Zhang等[6]采用qRT-PCR检测临床CRC原发癌组织及转移癌组织中lncRNA H19的表达，发现其表达显著上调并与CRC不良预后呈正相关，过表达lncRNA H19可促进CRC细胞迁移及EMT的发生。此外，lncRNA AGAP2-AS1在CRC中表达同样上调并参与CRC进展[7]。体内实验研究同样表明lncRNA参与CRC发生发展调控，Shang等[8]通过构建异种移植瘤模型，发现敲低lncRNA CCAT1组移植瘤生长受到明显抑制。另有研究指出，部分lncRNA在CRC中可发挥抑癌作用，Lin等[9]通过对CRC癌旁组织与原发癌组织中lncRNA AGER-1表达进行比较发现，其在原发癌组织中的表达显著下调，与CRC临床分期呈负相关，过表达AGER-1可抑制CRC增殖、迁移，诱导细胞周期阻滞，促进凋亡。lncRNA在CRC中具有促癌和抑癌双重作用，不同类型的lncRNA在CRC中可能发挥不同的作用，因此，lncRNA在CRC中的功能有待进一步深入探讨。

SNHG1是近年来新发现的lncRNA，其在多种不同类型的肿瘤中发挥促癌作用。Liu等[10]研究表明SNHG1在宫颈癌组织及细胞中的表达均上调，沉默SNHG1可显著降低宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭能力。SNHG1在脑膜瘤中同样具有促癌作用，SNHG1在脑膜瘤细胞中呈高表达，敲低SNHG1后可抑制脑膜瘤细胞生长[11]。Meng等[12]检测了前列腺癌组织和癌旁组织中SNHG1的表达，结果SNHG1均呈现高表达，并进一步通过细胞实验验证其对前列腺癌增殖、迁移、凋亡的影响，转染SNHG1干扰RNA可明显抑制前列腺癌细胞增殖、迁移，促进其凋亡。本研究探讨了SNHG1在CRC中的表达及功能，结果SNHG1在CRC HT29细胞的表达明显高于结直肠上皮FHC细胞，表明SNHG1在CRC中有可能同样发挥促癌效应，为验证SNHG1在CRC中的促癌效应，进一步对SNHG1能否促进CRC增殖、迁移进行了研究，以HT29细胞作为研究细胞，通过转染si-SNHG1 RNA以沉默SNHG1,MTT增殖实验结果表明，si-SNHG1组HT29细胞增殖能力在培养48 h、72 h时显著低于si-NC组，Transwell迁移实验结果表明，si-SNHG1组HT29细胞迁移能力显著低于si-NC组，提示SNHG1能够通过促进CRC增殖、迁移，发挥其促癌效应。

酪氨酸激酶-信号转导子与转录激活子（JAK-STAT）信号通路是由多种细胞因子介导的细胞内外信号转导通路，JAK-STAT信号通路广泛参与细胞分化、增殖、凋亡、免疫调控、炎症反应、肿瘤发生发展等病理生理过程[13,14]。已有研究表明，JAK-STAT信号通路在多种不同类型肿瘤进展过程中发挥着关键作用。Huang等[15]研究发现JAK-STAT信号通路在膀胱癌中呈活化状态，使用JAK-STAT阻断剂可显著抑制膀胱癌细胞增殖活性。C/EBPβ通过上调JAK-STAT信号通路活性促进乳腺癌增殖、侵袭及迁移[16]。此外，JAK-STAT信号通路在肝癌中的活性同样升高，Zhang等[17]采用qRT-PCR、Western blot等方法检测了肝癌组织和癌旁组织中JAK2、STAT3 mRNA和蛋白的表达，结果其在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织。另有研究报道指出，JAK-STAT信号通路在CRC中活化并参与CRC进展。Fang等[18]体外验证了CPEB3蛋白可抑制CRC增殖、迁移，敲低CPEB3蛋白表达后可上调JAK-STAT信号通路活性并促进CRC进展。在本研究中，为了进一步验证SNHG1促CRC增殖、迁移的分子机制，我们探讨了SNHG1与JAK-STAT信号通路的相关性，采用Western blot实验方法检测了si-SNHG1组、si-NC组HT29细胞中STAT3、P-STAT3的表达，结果STAT3在两组细胞中的表达无明显差异，与si-NC相比，P-STAT3在si-SNHG1组中的表达明显降低，STAT3是JAK-STAT信号通路中关键转录因子，其磷酸化被认为是该信号通路活化的重要标志，该实验结果提示SNHG1促CRC增殖、迁移作用与JAK-STAT信号通路活化有关。

综上所述，lncRNA SNHG1在CRC中呈高表达并能够促进CRC增殖、迁移，在调控机制方面，lncRNA SNHG1通过上调JAK-STAT信号通路活性进而发挥其促癌效应。本研究初步探讨了lncRNA SNHG1对CRC增殖、迁移的影响及调控机制，将为CRC临床诊治提供新的实验依据。

参考文献:

[4]陈猛云,樊晓明.长链非编码RNA在结直肠癌发生发展中的研究进展.复旦学报(医学版),2021,48(2):267-270.

[14]王欢,尼罗帕尔·吐尔逊,赵芳,等. JAK-STAT信号通路与骨髓增生异常综合征Th17/Treg细胞免疫失调相关性的研究[J].现代肿瘤医学,2022,30(10):1826-1831.

文章来源:曹强.长链非编码RNA SNHG1对结直肠癌增殖､迁移的影响及调控机制[J].黑龙江医学,2024,48(04):403-406.